Не отобразилась форма расчета стоимости? Переходи по ссылке

Не отобразилась форма расчета стоимости? Переходи по ссылке

Автореферат на тему «Функциональная взаимосвязь аммонийного (RhAG) и анионного (AE1) транспортеров эритроцитов человека»

Актуальность исследования. Сохранение аммонийного гомеостаза организма является важной, однако недостаточно изученной темой на стыке биологической и медицинской наук. Одним из маркеров нарушения биохимического гомеостаза является изменение концентрации ионов аммиака/аммония (NH3/NH4+) во внутренней среде.

Помощь в написании автореферата

Известно, что NH3/NH4+ транспортируются путем диффузии и белками-транспортерами, но точный механизм транспорта и характер переносимого субстрата в эритроцитах остаются неясными. В связи с этим детальное исследование трансмембранного транспорта и его механизмов позволит понять пути регуляции процессов, связанных с патологией азотистого обмена, и позволит вырабатывать более корректные и эффективные терапевтические подходы.

Аммиак/аммоний – постоянные побочные продукты катаболизма аминокислот и реакций дезаминирования, но при превышении допустимой концентрации они становятся цитотоксичными, поэтому метаболизм и транспорт NH3/NH4+ являются важными составляющими биологических процессов практически всех органов (Ludewig et al., 2001). У взрослого здорового человека концентрация NH3/NH4+ в крови поддерживается на уровне 30-60 мкМ (Diaz et al., 1995). Концентрация аммиака повышается (гипераммониемия), когда печень не способна более конвертировать аммиак в мочевину (цирроз, острый гепатит, печеночная недостаточность), или, когда продукция аммиака превышает метаболическую емкость печени (физическая нагрузка, инфекции мочевыводящих путей, чрезмерное развитие микрофлоры желудочно-кишечного тракта, лечение вальпроевой кислотой или химиотерапия) (Gifford et al., 2017). Повышение концентрации аммиака в крови наблюдается при наследуемых дефектах цикла мочевины (от 500 до 2000 мкМ), органической ацидурии (от 100 до 1000 мкМ), нарушении окисления жирных кислот (до 300 мкМ), при таких неонатальных заболеваниях как синдром Рейе (от 100 до 350 мкМ и транзиторная гипераммониемия новорожденных (от 150 мкМ до 4000 мкМ в тяжелых случаях) (Chou et al., 2004; LaGow et al., 2007; Niranjan-Azadi et al., 2016; Gifford et al., 2017;

Dasarathy et al., 2017). Аммиак легко диффундирует сквозь гематоэнцефалический барьер, поэтому в случае гипераммониемии велик риск возникновения энцефалопатии.

У человека основные органы, вовлеченные в генерацию, секрецию и экскрецию аммиака – печень, почки, кожа, кишечник экспрессируют аммонийные транспортеры Rhesus-гликопротеины RhCG и RhBG (Marini et al., 2000; Liu et al. 2001; Huang et al., 2001; Weiner et al., 2010). Изоформа аммонийного транспортера – RhAG экспрессируется исключительно в эритроцитах человека (Westhoff et al., 2002). Кроме того, в отличие от других клеток крови, эритроциты проявляют уникальную реакцию увеличения объема до критических значений и лизиса при помещении в изотоническую аммонийную среду (Jacobs, 1924; Chernyshev et al., 2008). Такое поведение клеток указывает на возможную вовлеченность эритроцитов в аммонийный метаболизм в качестве «захватчиков и переносчиков». Однако роль эритроцитов в аммонийном гомеостазе и азотистом обмене недостаточно изучена. В связи с этим важно выявить возможный вклад эритроцитов в поддержание оптимальной концентрации NH3/NH4+ в кровотоке. Известно, что RhAG связан структурно с анионным транспортером (AE1, белок полосы 3, Cl-/HCO3-обменник, SLC4A1), основным белком, регулирующим внутриклеточный pH (pHi) и механическую стабильность эритроцита (Bruce et al., 2003; Swietach et al., 2010). В связи с этим, представляется необходимым изучить возможное наличие функциональной взаимосвязи аммонийного и анионного транспортеров, в частности в условиях гипоксии, так как гемоглобин (Hb) в T- форме (дезокси-Hb) связывается с цитоплазменным доменом AE1 (cdAE1) (Zhang et al., 2003; Welbourn et al., 2017), что может влиять на транспортную функцию AE1. Однако, остается неясным, влияет ли такое взаимодействие на транспорт NH3/NH4+ эритроцитами.

В связи с вышеизложенным были определены следующая цель и задачи исследования.

Цель настоящей диссертационной работы – изучение функциональной взаимосвязи аммонийного (RhAG) и анионного (AE1) транспортеров   эритроцитов   человека   в   условиях   аммонийной   нагрузки.

В соответствии с поставленной целью, были сформулированы следующие конкретные задачи исследования:

1) Охарактеризовать способность   эритроцитов   человека    импортировать NH3/NH4+;

2) Оценить роль простой диффузии аммиака и транспорта аммония, обусловленного белками-транспортерами, в эритроциты человека в условиях импорта NH3/NH4+;

3) Выявить функциональную взаимосвязь между RhAG и AE1 транспортерами эритроцитов человека в условиях транспорта NH3/NH4+;

4) Охарактеризовать изменение    внутриклеточного   pH   (pHi)    и    объема эритроцитов человека в условиях импорта NH3/NH4+;

5) Исследовать влияние гипоксии на импорт NH3/NH4+ эритроцитами человека.

Научная новизна диссертации. В результате проведенных исследований охарактеризована способность    эритроцитов    импортировать    (захватывать) NH3/NH4+. Исследование функциональных характеристик эритроцитов в условиях аммонийной нагрузки позволило выявить, что транспорт NH3/NH4+ эритроцитами человека обусловлен, в основном, функционированием белков-транспортёров, а не простой  диффузией.   Впервые   предложено  объяснение   взаимосвязи  работы аммонийного и анионного транспортеров эритроцитов человека. Также в рамках работы впервые показано, что именно изменение объема эритроцита, а не изменение внутриклеточного pH, отражает импорт NH3/NH4+ в клетку. Таким образом, в результате исследования получены доказательства в пользу важной роли эритроцитов человека в аммонийном метаболизме организма.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Теоретическое значение работы состоит в расширении представлений о путях и механизмах азотистого обмена организма, в частности о роли эритроцитов в сохранении аммонийного гомеостаза и механизмах его опосредующих. Данное исследование имеет как теоретическое, так и прикладное значение. На основании исследования создан аммонийный тест, позволяющий оценивать не только хрупкость мембраны эритроцита (как широко распространенный в клинике тест на осмотическую резистентность эритроцитов), а также функциональные характеристики эритроцитов и активность мембранных белков-транспортеров. Тест на аммонийную резистентность эритроцитов уже применяется для корректировки терапии недоношенных новорожденных в критическом состоянии в «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д. О. Отта». В разработке находится тест-система для корректировки лечения пациентов с патологиями азотистого обмена и функционального состояния эритроцитов, в частности, пациентов, находящихся на терапии хроническим гемодиализом, и пациентов с заболеваниями печени. Полученные результаты и сделанные на их основе теоретические и практические выводы могут быть использованы при подготовке курсов лекций для студентов биологических и медицинских специальностей.

Научные положения, выносимые на защиту

  1. При физиологических условиях захват аммиака/аммония эритроцитами обусловлен, в большей степени, белками-транспортерами;
  2. Аммонийный (RhAG)  и  анионный  (AE1)   транспортеры  осуществляют сопряженный транспорт аммиака/аммония в эритроцитах человека;
  3. Наряду с транспортом респираторных газов, эритроциты транспортируют аммиак/аммоний, обеспечивая гомеостаз аммонийных форм в крови.

Личный вклад автора. Все экспериментальные данные, приведенные в диссертационной работе, получены лично автором или при его непосредственном участии. Автор проводил статистическую обработку полученных результатов, осуществлял их анализ, интерпретацию и обобщение, принимал участие в написании и подготовке публикаций по материалам работы.

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, 3 из которых – статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций, 3 статьи в сборниках материалов конференций, 6 тезисов докладов всероссийских и международных конференций, 1 глава в монографии.

Апробация работы. Результаты исследования представлены в виде устных и стендовых докладов на Всероссийской молодежной медицинской конференции с международным участием «Алмазовские чтения — 2018» (Санкт-Петербург, 2018); XV Всероссийском совещании с международным участием, посвященном памяти академика Л.А. Орбели и 60-летию ИЭФБ РАН (Санкт-Петербург, 2016); V Молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, 2016); III и IV Конгрессах гематологов России (Москва, 2016, 2018); International Congress of Cell Biology ICCB 2016 — 12th (Прага, Чехия, 2016); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2015, 2017); III Научно-технической конференции молодых ученых «Неделя науки – 2013» (СПбГТИ(ТУ), Санкт-Петербург, 2013); Международной конференции студентов и молодых ученых «Дни биохимии в СПбГМУ» с дипломом III степени (СПбГМУ, Санкт-Петербург, 2012).

Финансовая  поддержка  работы.  Работа  выполнена  при  финансовой поддержке РФФИ (№ 16-04-00632 «Сценарии гибели эритроцитов человека: условия формирования микрочастиц», 2016-2018 гг.), программы Президиума РАН (№ АААА-А18-118013190188-5 «Аммонийный стресс в условиях экстремальной физической нагрузки: концепция оценки и условия коррекции», 2018-2020 гг.), государственного задания ФАНО России (№ АААА-А18-118012290371-3, 2018г.). Структура и объем работы. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы по исследуемой теме – глава 1, описания методики – глава 2, описания результатов исследования – глава 3, их обсуждения – глава 4, заключения – глава 5, выводов и списка литературы, который включает 197 источников (из них 193 иностранных). Работа иллюстрирована 30 рисунками и 2 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах были использованы следующие материалы и реактивы: закрытые системы взятия венозной крови S-Monovette® (натрия цитрат — 3.2%, 2 мМ ЭГТА), специфический ингибитор анионного транспортера, 4,4′- диизотиоциано-2,2′-стилбендисульфоновая кислота (DIDS), pH-чувствительный флуорофор BCECF-AM, нигерицин, ammonia assay kit, HEPES, NaCl, KCl, MgCl2, NH4Cl, NaHCO3, D-глюкоза, EGTA, нитропруссид натрия (sodium nitroprusside, SNP). Для приготовления рабочих сред использовали (мМ изотонический физиологический буфер — среда № 1 (NaCl, 140; KCl, 5; HEPES, 10; MgCl2, 1.5, D- глюкоза, 5; EGTA, 2); изотонический физиологический буфер с гидрокарбонатом — среда № 1 mod (NaCl, 135/115; KCl, 5; HEPES, 10; MgCl2, 1.5, D-глюкоза, 5; EGTA, 2; NaHCO3, 5/25); изотонический аммонийный буфер — среда № 2 (NH4Cl, 140; KCl, 5; HEPES, 10; MgCl2, 1.5, D-глюкоза, 5); изотонический аммонийный буфер с гидрокарбонатом — среда № 3 (NH4Cl, 120; KCl, 5; HEPES, 10; MgCl2, 1,5, D- глюкоза, 5; NaHCO3, 25); В экспериментах с различными концентрациями NH4Cl среду №2 модифицировали эквимолярным замещением NH4+ на Na+. В экспериментах с участием ионов гидрокарбоната среду №2 модифицировали эквимолярным добавлением среды №3.

Подготовка суспензии эритроцитов. Суспензию эритроцитов получали после двукратной промывки венозной крови здоровых доноров изотоническим буфером (среда №1, pH 7.4, 300 мосм/кг H2O). Основные параметры отбираемой крови и суспензии эритроцитов (концентрация эритроцитов – RBС, объем эритроцита – MCV) контролировали на гематологическом анализаторе Medonic- M20 (Boule Medical A.B.).

Импорт NH4+/NH3 эритроцитами. Отмытые эритроциты (гематокрит 10%) ресуспендировали в среде №1, в термошейкере (37°С, 300 rpm). Пробы отбирали центрифугированием (6000 rpm, 10 c, Eppendorf 5415D) до добавки NH4Cl (100, 200, 800 мкМ) 0 – 4 мин (контроль) и через 1, 3, 6, 9, 12, 30 мин после добавки NH4Cl. В экспериментах с ингибированием AE1 суспензию отмытых эритроцитов предварительно инкубировали с блокатором AE1 – DIDS (100 мкМ, 30 мин, 37°С). Способность эритроцитов захватывать NH4+/NH3 оценивали по убыли аммония в супернатанте эритроцитов методом определения аммония в биологических жидкостях (ammonia assay kit, согласно инструкции производителя), адаптированным для 96-луночного планшета.

Метод лазерной дифракции. Изменение объема клеток (MCV) и начальной скорости увеличения их объема (Vi) в условиях различной концентрации NH4Cl, HCO3–, температуры и pH среды исследовали на лазерном анализаторе частиц LaSca-TM (БиоМедСистем). Изменение начальной скорости увеличения объема клеток (Vi) характеризовали по данным кинетики прямого светорассеяния под углом 1°. Также использовали параметры Them (время достижения максимальной скорости гемолиза) и Vhem (максимальная скорость гемолиза) для количественного описания кинетики гемолиза. В основе метода – регистрация рассеянного излучения под разными углами с помощью многоэлементного детектора. По полученной зависимости интенсивности рассеянного излучения от угла рассеяния (индикатриса рассеяния) осуществляется расчёт размеров частиц и распределения частиц по размерам, таким образом в каждый момент времени считывается распределение всей популяции по объемам. Для контроля определения среднего объема клеток в качестве входного значения для расчета используются данные гематологического счетчика (Medonic-M20). Для оценки динамики изменения объема клеток использовали программное обеспечение для оценки размеров частиц LaSca_32.

Метод проточной цитометрии. Цитометрические исследования проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter). Измерение внутриклеточного pH (pHi). Определение относительных значений внутриклеточного pH эритроцитов проводили с помощью флуорофора BCECF- AM. Флуорофор вводили в суспензию отмытых эритроцитов (106 кл/мл) в форме ацетоксиметилового эфира – AM, 5 мкМ. Клетки инкубировали с красителем в термошейкере TS-100 BIOSAN (30 мин, 37°С, встряхивание), 3 раза отмывали физиологическим раствором и до проведения эксперимента хранили при 4°С (для предотвращения выхода красителя из клеток). Измерение интенсивности флуоресценции BCECF проводилось в соответствии с протоколом по использованию флуорофора ратиометрическим методом (по соотношению эмиссий), при 25°С. Калибровка значений pHi. Калибровку значений pHi проводили с помощью калиевого ионофора нигерицина согласно инструкции производителя. Измерение объема эритроцитов. В экспериментах по исследованию pHi по данным прямого светорассеяния в линейном диапазоне (параметр FS INT LIN) регистрировали относительные объемные характеристики клеток.

Спектроскопия. Спектр гемоглобинов (Hb) анализировали сканирующим спектрофотометром СПЕКС ССП-715-М (ООО «Спектроскопические системы»), диапазон от 400 до 700 нм, с шагом длины волны 0.1 нм (щель 0.8), режим термостатирования   кюветы.   Отмытые   эритроциты   (106     кл/мл)   вносили   в изотонический буфер (среда №1, 25°С, 37°С), снимали спектры Hb цельных клеток. Связывание лигандов гемоглобином. Для получения спектров окси-Hb использовали эритроциты (106 кл/мл) в условиях нормоксии, затем суспензию барботировали аргоном (2 мин) для вытеснения кислорода, закрывали кювету герметезирующей пленкой (Parafilm-M) и снимали спектры в условиях гипоксии (дезокси-Hb). Для получения спектра NO-Hb, в гипоксическую суспензию вносили донор NO – SNP, 10 мкМ.

Гипоксия. Гипоксию создавали дегазированием суспензии аргоном в течение 2 мин. Содержание кислорода контролировали с помощью кислородного датчика mini-Oksik 3 («Аналитика-Сервис») в гипоксической камере (Billups Rothenberg). Во время измерения спектров кювету запечатывали герметизирующей пленкой (Parafilm) для сохранения гипоксических условий.

Статистический анализ. Полученные данные были статистически обработаны с использованием компьютерных программ МS Excel и GraphPad Prizm

6. При сопоставлении достоверности различий между связанными выборками использовали критерий Уилкоксона, при сопоставлении достоверности различий для трех и более групп – тест Краскела-Уоллиса. Во всех экспериментах данные представлены как среднее ± SD. Различия считались значимыми при p<0.05. Количество экспериментов в каждой серии не менее 4.

Нужна помощь в написании автореферата?

Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.

Цена автореферата

Результаты и обсуждение

Эритроциты человека импортируют NH4+/NH3. Установлено, что в норме соотношение аммония, содержащегося в эритроцитах и в плазме крови, составляет около 3 к 1 (Seligson et al., 1957; Conn, 1966; Huizenga et al., 1994; Conn, 1992). При долговременном хранении крови в банках переливания крови было выявлено увеличение концентрации NH + в плазме до 419 ± 70 мкМ (Barta et al., 1982). Учитывая показатели нормы плазмы – до 60 мкМ, эти результаты свидетельствуют о том, что эритроциты могут депонировать NH3/NH +. Соответственно, в этих клетках должна существовать система импорта/экспорта NH3/NH +. В связи с этим первой задачей нашего исследования являлось выявление способности эритроцитов импортировать аммиак/аммоний. Для решения поставленной задачи ферментативный метод определения аммония в биологических образцах был адаптирован для 96-луночного планшета. Сначала были получены калибровочные кривые для NH4Cl и (NH4)2SO4, которые полностью совпадали.

При концентрации NH4Cl близкой к физиологической — 100 мкМ, происходил захват аммония эритроцитами (79±5%, n=4), эффект воспроизводился и при патофизиологических концентрациях 200 мкМ и 800 мкМ. Через 1 мин после добавки в суспензию эритроцитов 200 мкМ NH4Cl концентрация аммония в супернатанте уменьшалась на 47±5% (n=4) и оставалась на таком уровне вплоть до 30 мин после внесения 200 мкМ NH4Cl (Рисунок 1б). После добавки 800 мкМ концентрация аммония в супернатанте уменьшалась на 59±7% (n=4) и держалась на таком уровне в течение 30 мин. Блокирование функции анионного транспортера при 100 мкМ NH4Cl ингибировало поглощение аммония эритроцитами на 35±5% (n=4), при 800 мкМ NH4Cl — на 34±2% (n=4).

Приведенные выше данные указывают на то, что в эритроцитах человека присутствует система импорта аммиака/аммония, позволяющая захватывать и депонировать аммиак/аммоний. Ингибирование захвата аммония в условиях блокирования AE1 свидетельствует о вовлеченности анионного транспортера в импорт аммония/аммиака эритроцитами.

Изменение объема эритроцитов при аммонийной нагрузке коррелирует с импортом NH3/NH4+ эритроцитами. Для выявления соотношения вклада простой диффузии и функционирования белков-транспортеров в процесс импорта NH3/NH4+ в эритроциты мы использовали метод лазерной дифракции, активно используемый для исследования изменения функциональных характеристик клеток крови (Mindukshev et al., 2010, 2012, 2016). В отличие от других клеток крови, эритроциты человека, помещенные в изотоническую аммонийную среду, увеличивают объем до критического и лизируют (Jacobs, 1924).

В экспериментах с аммонийной нагрузкой (среда № 2) увеличение объема эритроцитов регистрировалось как повышение интенсивности рассеяния в диапазоне ближних углов (до 6°) и снижение сигнала в диапазоне углов от 6° до 12°. Во время гемолиза интенсивность светорассеяния уменьшалась во всех углах сканирования. Такое разнохарактерное поведение сигналов позволило разделить фазу увеличения объема и фазу лизиса. Оценка распределения клеток по объему (Рисунок 2в) показала, что при 25-37°С клетки увеличивают объем от 85-90 fL в норме, что соответствует данным литературы (Mohandas et al., 2008; Richardson et al., 2016), до 150±10 fL (n=8), после чего лизируют. До начала лизиса динамика изменения интенсивности светорассеяния в 1° совпадала с динамикой изменения среднего объема клеток (MCV).

Таким образом, начальная скорость увеличения сигнала является адекватной характеристикой скорости начального увеличения объема клеток (Vi) и может быть использована как маркер входа NH3/NH4+  в клетку (Рисунок 2а, б).

Транспорт NH3/NH4+ в эритроциты обусловлен, в большей степени, функционированием белков-транспортеров. Дифференцировка простой диффузии и белкового транспорта возможна на основании температурной чувствительности: зависимость простой диффузии от температуры – линейная, зависимость транспорта, обусловленного белками-транспортерами – экспоненциальная   в   исследуемом   диапазоне   температур   (от   10   до   40°С).

Температурный коэффициент Вант-Гоффа Q10 отражает влияние температуры на скорость биологических процессов. В условиях простой диффузии NH3 при увеличении температуры на 10°С скорость транспорта должна возрастать незначительно – 10-20% (Q10 близок к 1), тогда как при работе белков- транспортеров, согласно правилу Вант-Гоффа, температурный коэффициент должен находиться в диапазоне от 2-х до 3-х (Ito et al., 2015).

Методом лазерной дифракции мы исследовали температурный диапазон от 10 до 40°С (Рисунок 3). Зависимость начальной скорости увеличения объема клеток от температуры при аммонийной нагрузке представлена в координатах Аррениуса, где логарифм скорости линейно зависит от обратной температуры [lnV=f(1/T)] (Рисунок 3). В наших экспериментах величина Q10 составила 2.6±0.3.

Помимо температурной зависимости, работа белков-транспортеров характеризуется зависимостью от pH, наличием pH-оптимума (Talley et al., 2010). Уравнение Гендерсона-Гассельбаха (pH=pKa+ln(A-/HA), где A- — кислота, HA – соль, Ka – константа диссоциации кислоты) описывает процентное соотношение протонированной и нейтральной форм в водном растворе в зависимости от pH среды. В соответствии с этим уравнением были рассчитаны зависимости скорости диффузии проникающей формы NH3 от pH (Рисунок 4, пунктирные линии) для температур 10ºС и 37ºС.

На рисунке 4 серая пунктирная линия характеризует процесс простой диффузии, при pKa 9.7, соответствующей температуре 10ºС, и красная пунктирная линия – при pKa 8.9, соответствующей 37ºС. Процесс простой диффузии характеризуется экспоненциальной зависимостью от pH, с отсутствием зависимости от узких диапазонов концентраций H+.

Влияние pH среды на начальную скорость увеличения объема эритроцитов было исследовано при различных температурах (ºС): 10, 25, 37. Была выявлена колоколообразная зависимость (pH-оптимум) для температур 37ºС (Рисунок 4, красная линия) и 25ºС (Рисунок 4, голубая линия) при 7.4±0.1 (n=8). При 10ºС скорость начального увеличения объема возрастала экспоненциально, с отсутствием pH-оптимума (Рисунок 4, серая линия). При сравнении экспериментально полученной зависимости Vi эритроцитов при 25 и 37ºС (Рисунок 19, красная и голубая линии) с теоретически рассчитанными зависимостями (Рисунок 19, пунктирные линии) не было выявлено корреляции, что указывает на преобладание  процессов,  обусловленных  работой  белков-транспортеров  при температурах выше 25 ºС. Полученная экспериментально зависимость при 10ºС коррелирует с теоретически рассчитанной кривой, характеризующей простую диффузию, что говорит о преобладании процесса простой диффузии NH3 при 10ºС. Таким образом, температурный коэффициент Q10 находится в диапазоне значений от 2 до 3, что указывает на вовлеченность в процесс конформационного изменения белков-транспортеров. Полученные данные указывают на то, что белковые системы импорта NH3/NH + в эритроцитах играют значительную роль, в сравнении с простой диффузией аммиака в клетку. Наличие pH-оптимума при 25ºС и 37ºС является дополнительным аргументом в пользу активного участия белков-транспортеров в транспорте NH3/NH + через мембрану эритроцита при температурах выше 25ºС.

Функционирование анионного транспортера влияет на импорт аммиака/аммония эритроцитами. В экспериментах по исследованию способности эритроцитов захватывать аммиак/аммоний специфический блокатор анионного транспортера (DIDS) ингибировал импорт на 34±2% (n=4) при 800 мкМ NH4Cl и на 35±5% (n=4) при 100 мкМ NH4Cl (Рисунок 1б, в). Для дальнейшего исследования вклада AE1 в импорт NH3/NH4+ были проведены эксперименты с субстратом AE1 – HCO3-. Добавление гидрокарбоната в среду вызывало зависимое от концентрации увеличение Vi. Полученная зависимость описана сигмоидной кривой «доза-эффект» с ЕС50 =4.7 мМ±0.3 (коэффициент Хилла h=1.8±0.4) (Рисунок 5в). Обработка данных скорости увеличения объема эритроцитов при 10ºС и 37ºС ([HCO3-] = 25 мМ) позволила соотнести вклады простой диффузии и транспорта, обусловленного белками-транспортерами, в процесс импорта NH3/NH4+ эритроцитами, которые составили 4.6±0.8% и 96.4±2.9% (n=8), соответственно (рис.5а-б). При физиологической концентрации 25 мМ HCO3– (37ºС) скорость начального увеличения объема эритроцитов увеличивалась в 48.6±3.4 раз (n=10, p<0.036, тест Краскела-Уоллиса) по сравнению с его отсутствием в среде (рис.5а-б), что указывает на важную роль анионного транспортера в исследуемом процессе.

При помещении эритроцитов в изотоническую аммонийную среду (среда № 2) наблюдалось увеличение объема клеток на 80% (то есть до 150±10 fL (n=8), согласно данным лазерной дифракции) по сравнению с контрольными клетками с последующим гемолизом по достижении клетками максимального объема (относительные данные проточной цитометрии – Рисунок 6, гейт 3, гейт 1, гейт 4, соответственно).

При ингибировании анионного транспортера в присутствии 300 мкМ DIDS наблюдалось значительно меньшее увеличение объема по сравнению с аммонийной нагрузкой без ингибирования AE1 (на 30%), блокирование AE1 полностью предотвращало лизис клеток (относительные данные проточной цитометрии — Рисунок 6, гейт 5-6).- изотоническую аммонийную среду (среда №2, pH 7.4) с добавлением 300 мкМ DIDS; Представлены данные прямого светорассеяния в линейном диапазоне (FS INT LIN), являющиеся характеристикой объема; 1-6 – репрезентативные популяции эритроцитов, гейты, для которых даны распределения на рис.6: гейт 1 – контрольные клетки, гейты 2-4 – клетки при разных стадиях аммонийной нагрузки (140 мМ NH4Cl), гейты 5, 6 – клетки при аммонийной нагрузке в условии ингибирования eAE1 (300 мкМ DIDS) в начале опыта и в конце, соответственно. Оригинальный эксперимент на проточном цитометре, обработка с помощью Cytometry List Mode Data Aquisition&Analysis Software.

При добавлении клеток в среду, содержащую 100 мМ NH4Cl (максимальная концентрация NH +, не вызывающая лизиса), наблюдалось быстрое внутриклеточное защелачивание и последующее вторичное закисление (Рисунок 7). Максимальное значении pHi достигалось в течение 5 — 10 с. Объем клеток продолжал увеличиваться и достигал максимума (135±2 fL, n=9) через 40 с, хотя уже  наблюдался  процесс  компенсаторного  закисления  внутриклеточной среды так и увеличение объема, проходило значительно быстрее.

Таким образом, изменение объема эритроцита, в сравнении с изменением внутриклеточного pH, является более информативным параметром, характеризующим импорт NH3/NH +в эритроцит.

Ингибирование гемолиза в аммонийной среде в условиях гипоксии. Взаимодействие гемоглобина (Hb) c лигандами определяется оксигенированностью среды и конформационным состоянием Hb, T- или R-форма. R-форма (окси-Hb) практически не связывается с мембраной, однако, при изменении конформации на T-форму (дезокси-Hb), Hb может связываться с мембраной через сайт прикрепления, расположенный в цитоплазматическом домене анионного транспортера AE1 — cdAE1 (Mihailescu et al., 2001; Chu et al., 2008, 2016). При связывании Hb с AE1 увеличивается взаимодействие цитоскелета и AE1 (Barvitenko et al., 2001), что, предположительно, снижает активность анионного транспортера.

Известно, что в условиях гипоксии (Stepuro, Zinchuk, 2006) лигандирование гемоглобина NO способно переводить Hb из T- в R-форму. В связи с этим, мы использовали SNP в качестве донора NO. Cостояния Hb контролировали спектроскопическим методом.

Нужна помощь в написании автореферата?

Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.

Заказать автореферат

Влияние гипоксии на Vi в аммонийной среде оценивалось методами проточной цитометрии (Рисунок 9а) и лазерной дифракции (Рисунок 9б). Скорость начального увеличения объема (Vi) эритроцитов, содержащих дезокси-Hb, была в 2.23±0.50 (n=8, p≤0.05) раза ниже, чем у эритроцитов, содержащих окси-Hb. Одновременно с этим, при гипоксии (эритроциты с дезокси-Hb) достоверно (в 2.31±0.17 раза, n=8, p≤0.05) увеличивалось время гемолиза клеток. Образование NO-производных Hb не оказывало существенного влияния на кинетические характеристики гемолиза в условиях нормоксии, Vi и время лизиса сохранялись на уровне контрольных значений. Перевод Hb в R-форму (NO-Hb) в условии гипоксии возвращал Vi на уровень, близкий к контролю (окси-Hb), при этом время гемолиза достоверно (в 1.25±0.18 раза, n=8, p≤0.05) уменьшалось. Данные проточной цитометрии коррелировали с данными лазерной дифракции (Рисунок 9а, б)

Таким образом, при гипоксии ингибировался транспорт NH3/NH +, в то время как изменение формы Hb с T- на R-форму в этих же условиях возвращало показатели кинетики транспорта NH3/NH + на уровень, близкий к контролю. В соответствии с этим, можно заключить, что транспорт NH3/NH + в эритроциты зависит от конформационного состояния Hb.

Заключение

Представленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что импорт NH3/NH4+ обусловлен в большей степени транспортерами белковой природы (96.4±2.9%, n=8), чем простой диффузией NH3 через мембрану эритроцита (4.6±0.8%, n=8). Данные кинетики транспорта NH3/NH4+ однозначно указывают на функциональную взаимосвязь анионного обменника AE1 и аммонийного транспортера RhAG в условиях импорта NH3/NH + в эритроциты. Кроме того, было выявлено, что скорость импорта NH3/NH4+ в гипоксических условиях снижается. На основании литературных данных (Khademi et al., 2006) и проведенного исследования, была предложена схема импорта NH3/NH + (Рисунок 10), обусловленного функциональным сопряжением AE1 и RhAG транспортеров, учитывая влияние форм гемоглобина.

Выводы

1) Эритроциты человека импортируют аммиак/аммоний при физиологических и патофизиологических концентрациях NH4+ во внешней среде;

2) Транспорт аммиака/аммония эритроцитами человека в физиологических условиях обусловлен, главным образом, функционированием белков- транспортеров, а не простой диффузией электронейтральной формы NH3, чтоподтверждено установленными параметрами импорта аммиака/аммония эритроцитами: зависимостью от температуры с Q10=2.6±0.3; колоколообразной зависимостью от pH среды с pH оптимумом 7.4±0.1; s-образной зависимостью от концентрации гидрокарбоната с EC50=4.7±0.3 мМ;

3) Импорт аммиака/аммония в эритроциты зависит от активности анионного транспортера, так как блокатор анионного транспортера ингибирует импорт, а в условиях изотонической аммонийной среды при 37ºС и физиологической концентрации субстрата анионного транспортера (гидрокарбоната) скорость импорта аммония/аммиака увеличивается практически в 50 раз;

4) Изменение объема эритроцита, в сравнении с изменением внутриклеточного pH, является более информативным параметром, характеризующим импорт аммиака/аммония в эритроцит;

5) В условиях гипоксии при связывании деоксигемоглобина с цитоплазматическим доменом AE1 выявлено ингибирование транспорта аммиака/аммония в эритроцитах;

6) Cопряженное функционирование анионного (AE1) и аммонийного (RhAG) транспортеров позволяет эритроцитам поддерживать физиологическую концентрацию аммиака/аммония в крови.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:
1. Судницына Ю. С., Скверчинская Е. А., Добрылко И. А., Никитина Е. Р., Кривченко А. И., Гамбарян С. П., Миндукшев И. В. Функциональная взаимосвязь аммонийного (RhAG) и анионного (AE1) транспортеров эритроцитов человека. / Биологические мембраны. 2016. T.33. №5. C. 363-373. DOI: 10.7868/S0233475516050091.
2. S. Gambaryan, H. Subramanian, L. Kehrer, I. Mindukshev, J. Sudnitsyna, C. Reiss, N. Rukoyatkina, A. Friebe, I. Sharina, E. Martin, U. Walter. Erythrocytes do not activate purified and platelet soluble guanylate cyclases even in conditions favourable for NO synthesis. / Cell Commun Signal. 2016. V. 14 (16). P.1-12. DOI:10.1186/s12964- 016-0139-9.
3. Ю. С. Судницына, С. П. Гамбарян, А. И. Кривченко, И. В. Миндукшев. Импорт аммиака/аммония в эритроциты человека. / Биологические мембраны. 2018. Т.35. №5. С. 398–402. DOI: 10.1134/S0233475518040163.
Статьи, опубликованные в других рецензируемых изданиях:
Mindukshev I., Kudryavtsev I., Serebriakova M., Trulioff A., Gambaryan S., Sudnitsyna J., Khmelevskoy D., Voitenko N., Avdonin P., Jenkins R. and Goncharov N. Flow cytometry and light scattering technique in evaluation of nutraceuticals. / in

Neutraceuticals. Efficacy, Safety and Toxicity. Elsevier. 2016. P.319-332. ISBN 978-0- 12-802147- 7.
Статьи, опубликованные в сборниках материалов конференций:
1. Ю. С. Судницына, С. П. Гамбарян, И. А. Добрылко, Е. Н. Якимов, М. Ф. Баллюзек, А. И. Кривченко, И. В. Миндукшев. Функциональная сопряженность анионного (AE1) и аммонийного (RhAG) транспортеров эритроцитов человека. / Сб. статей Межд. конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», 25- 28 мая 2015г., Пущино. 2015. Т1. С. 74-79.
2. Гамбарян С. П., Миндукшев И. В., Рукояткина Н. И., Судницына Ю. С., Скверчинская Е. А., Якимов Е. Н., Баллюзек М. Ф., Кривченко А. И. Эритроциты не продуцируют биологически активный оксид азота. / Сб. статей Межд. конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», 25-28 мая 2015г., Пущино. 2015. Т1. С.9-14.
3. Ю. С. Судницына, С. П. Гамбарян, Е. А. Скверчинская, А. И. Кривченко, И. В. Миндукшев. Особенности регуляции внутриклеточного pH в эритроцитах человека. / Сб. статей Межд. конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», 25-28 мая 2017г., Пущино. 2017. С. 562-565.
Тезисы докладов:
1. J. Sudnitsyna, E. Skvertchinskaya, A. Krivchenko, S.Gambaryan, I. Mindukshev. Cooperation of RhAG and AE1 transporters enables erythrocytes to accumulate ammonia. / Proceedings of the 12th International Congress of Cell Biology July 21-25 2016, Prague. P.201. POSTER P125
2. Ю. С. Судницына, Е. А. Скверчинская, И. А. Добрылко, Е. Р. Никитина, С. П. Гамбарян, И. В. Миндукшев. Эффективный механизм транспорта аммония/аммиака эритроцитами человека. / Тезисы III Конгресса гематологов России. Гематология и трансфузиология. 2016. Т.61. № S1(1). С. 181.
3. E. Y. Senchenkova, E. Skvertchinskaya, I. Dobrylko, J. Sudnitsyna, S. Gambaryan, I. Mindukshev, F. Gavins. Experimental Oxidative Stress-Induced Death of Erythrocytes. / FASEB. 2017. V.31. №1(S). lb761.
4. Ю. С. Судницына, С. П. Гамбарян, Н. В. Гончаров, И. В. Миндукшев, А. И. Кривченко. Эритроциты человека способны импортировать аммоний при повышении его концентрации во внеклеточной среде. / Тезисы IV Конгресса гематологов России. Гематология и трансфузиология. 2018. Т.63. № S1. С. 184.
5. А. Ю. Андреева, Е. А. Скверчинская, А. И. Кривченко, И. В. Миндукшев, Ю. С. Судницына. Конформационное состояние гемоглобина регулирует функциональную активность анионного транспортера эритроцитов человека. / Тезисы IV Конгресса гематологов России. Гематология и трансфузиология. 2018. Т.63. № S1. С. 113.
6. Судницына Ю. С. Импорт аммиака эритроцитами зависит от активности анионного транспортера (eAE1). / Тезисы Всероссийской молодежной медицинской конференции с международным участием «Алмазовские чтения – 2018». Трансляционная медицина. 2018. Приложение№3. С.139.

Средняя оценка 0 / 5. Количество оценок: 0

Поставьте оценку первым.

Сожалеем, что вы поставили низкую оценку!

Позвольте нам стать лучше!

Расскажите, как нам стать лучше?

838

Закажите такую же работу

Не отобразилась форма расчета стоимости? Переходи по ссылке

Не отобразилась форма расчета стоимости? Переходи по ссылке