Автореферат на тему «Морфофункциональные и иммунологические аспекты взаимоотношений в системе паразит – хозяин: цестоды – рыбы»

Актуальность и степень разработанности темы исследования. В последние годы значительно возрос интерес исследователей к выяснению механизмов, используемых паразитами для уклонения от иммунного ответа хозяина или регуляции его иммунной системы. Эти адаптивные механизмы были изучены, главным образом, у некоторых трематод и нематод, имеющих важнейшее медицинское и ветеринарное значение. Информации по исследованию цестод в этом отношении крайне мало (Давыдов, Микряков, 1988; Terrazas, 1998; Garg, Ranganathan, 2012; Peón et al., 2016).

Скачать пример Заказать работу Скачать пример Заказать работу

Введение
1. История изучения иммунологических аспектов взаимоотношений в системах «паразит – хозяин»
2. Материалы и методы
3. Микроморфологические изменения цестод при воздействии сыворотки крови их хозяев
4. Выработка и распределение иммунорегуляторных молекул в организме цестод, паразитирующих в рыбах
5. Регуляторное влияние цестод на иммунную систему хозяев – рыб
6. Анализ иммунологических аспектов взаимоотношений в системах «цестоды – рыбы»
Заключение
Список использованных источников

Введение

Исследование защитных механизмов было проведено на половозрелых стадиях паразитов и окончательных хозяевах – млекопитающих. Однако не меньшее значение имеет исследование защиты паразитов от иммунологических реакций промежуточных хозяев, принадлежащих к низшим позвоночным.

Огромную роль — в жизненных циклах паразитов в качестве промежуточных хозяев играют рыбы (Sitja`-Bobadilla, 2008). В последние годы мировая аквакультура резко увеличила свою продукцию. Однако параллельно отмечается увеличение паразитарных заболеваний рыб, что приводит к серьезному урону в рыбоводной промышленности (Clifton-Hadley et al., 1986; Moran et al., 1999; Johnson et al., 2004; Krkosek et al., 2006).

Цестодозы — в некоторых эндемичных регионах по своему эпидемиологическому и эпизоотическому значению выходят на первый план среди остальных гельминтозов. На территории России ежегодно дифиллоботриозом заболевает более 6 тысяч человек (Беляев и др., 2001; Верещагин и др., 2010, 2014). Причиной заболеваний являются лентецы рода Diphyllobothrium, паразитирующие на стадии плероцеркоида как в пресноводных, так и морских видах рыб (Сердюков, 1979; Делямуре и др., 1985; Довгалев и др., 1991, 1996; Довгалев, 1998; Arizono et al., 2009). В ряде северных районов Сибири и в Прибайкалье, включая Республику Бурятия, основным возбудителем дифиллоботриоза человека и животных является лентец чаечный Diphyllobothrium dendriticum.

Лигулез (диграммоз) рыб – тяжелая паразитарная болезнь карповых рыб, вызываемая плероцеркоидами ленточных червей рода Ligula (Digramma), которые локализуются в брюшной полости рыб. Заболевание приводит к дисфункции и атрофии внутренних органов, больная рыба всплывает на поверхность и в большом количестве гибнет, становясь добычей рыбоядных птиц и хищных рыб. В настоящее время потери рыбопродукции от этого заболевания составляют, в среднем, 15% (Дубинина, 1966; Апсолихова, 2010).

Ранее изучалось регуляторное влияние целых паразитических организмов, либо их секреторно-экскреторных продуктов на иммунитет хозяев. На современном этапе развития паразитологии большое внимание уделяется идентификации отдельных иммунорегуляторных веществ, экскретируемых паразитами в ткани хозяев (Maizels et al., 2004; Fallon, Alcami, 2006; Adisakwattana et al., 2009; Hewitson et al., 2009; Johnston et al., 2009; Hernandez et al., 2013; McSorley et al., 2013; Hewitson et al., 2016). Актуальными стали разработки лечения аутоиммунных заболеваний с использованием иммунорегуляторных веществ, вырабатываемых гельминтами (Ebner et al., 2014).

Адаптивные механизмы защиты паразитов от иммунной системы хозяев исследованы, главным образом, биохимическими методами. Микроморфологические исследования реализации этих механизмов у паразитов, включая цестод, почти полностью отсутствуют. Данных литературы о локализации иммунорегуляторных молекул в организме паразитов чрезвычайно мало. К началу выполнения данной работы в литературе были представлены единственные данные о распределении иммунорегуляторного вещества – простагландина Е₂ в организме нематоды Onchocerca volvulus (Brattig et al., 2006).

К настоящему времени механизмы защиты плероцеркоидов цестод от иммунной системы рыб не изучены совершенно, в том числе не изучен и спектр иммунорегуляторных молекул цестод. До сих пор неизвестно, какие типы клеток продуцируют иммунорегуляторные молекулы у цестод. Не известно также воздействие отдельных иммунорегуляторных молекул цестод на иммунную систему рыб. Несмотря на наличие данных по изменению показателей иммунной системы рыб при инвазии цестодами, остается не совсем ясным вклад иммунорегуляторного влияния цестод в эти изменения.

Цель и задачи исследования

Основная цель работы – изучить морфофункциональные и биохимические аспекты адаптации плероцеркоидов цестод к воздействию иммунной системы их хозяев – рыб.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ультраструктурные особенности выведения плероцеркоидами цестод секреторных продуктов на поверхность тела в ответ на воздействие in vitro сыворотки крови хозяев – рыб.

2. Изучить на ультраструктурном уровне изменения в организме плероцеркоидов цестод в ответ на воздействие in vitro сыворотки крови хозяев – рыб.

3. Провести иммуноцитохимическое исследование распределения в организме плероцеркоидов цестод потенциальных регуляторов иммунной системы – простагландинов (PG) E₂ и D₂, нейроактивных субстанций серотонина, гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), нейропептида FMRFамида.

4. Определить наличие и концентрацию в организме плероцеркоидов цестод потенциальных регуляторов иммунной системы – простагландинов E₂ и D₂, а также выведение этих веществ наружу в ответ на воздействие сыворотки крови хозяев.

5. Изучить in vitro влияние потенциальных регуляторов иммунной системы – простагландинов E₂ и D₂, серотонина, ГАМК на показатели лейкоцитов рыб.

6. Исследовать изменения лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб при инвазии плероцеркоидами цестод.

7. Провести сравнительный анализ иммунологических реакций промежуточных и окончательных хозяев при инвазии их цестодами.

8. Провести сравнительный анализ иммунологических реакций рыб при инвазии цестодами и заражении патогенными бактериями.

Научная новизна исследования. Работа представляет собой первое комплексное исследование механизмов адаптации паразитов к антипаразитарной иммунологической реакции хозяев, с одной стороны, а с другой стороны – иммунологической реакции хозяев в ответ на заражение паразитами. Впервые показано, что плероцеркоиды цестод обладают морфологическими и биохимическими механизмами защиты от воздействия иммунной системы хозяев – рыб.

Впервые изучены микроморфологические и биохимические особенности реакций плероцеркоидов в ответ на воздействие сыворотки крови хозяев. Установлено, что при таком воздействии усиливается секреторная активность тегумента. Обнаружены две разновидности вывода секрета на поверхность тела плероцеркоидов: оформленные и неоформленные секреторные продукты.

В тегументе выявлены апокриновый и мерокриновый типы секреции, а также экскреция везикул с поверхности свободных нервных окончаний в поры тегумента. Показано, что плероцеркоиды способны секретировать широкий спектр мембранно-ограниченных продуктов. Впервые установлена важная роль органоидов дистальной цитоплазмы тегумента – палочковидных гранул, дисковидных тел, везикул и вакуолей – в защитных реакциях цестод. Доказана секреция цестодами простагландинов (PG) Е₂ и D₂ в ответ на стимуляцию сывороткой крови хозяев.

Впервые для плероцеркоидов доказана выработка иммунорегуляторных молекул – простагландинов Е₂ и D₂ и установлена их концентрация в организме плероцеркоидов. Впервые установлена локализация этих простагландинов в организме плероцеркоидов: PGЕ₂ – впервые для паразитических плоских червей; PGD₂ – для группы паразитических червей в целом. Показана возможность секреции этих простагландинов в ткани хозяина с поверхности свободных нервных окончаний в тегументе, через протоки фронтальных желез и выделительную систему.

Впервые исследованы микроморфологические особенности локализации нейроактивных субстанций, потенциальных нейро- и иммунорегуляторов в организме плероцеркоидов: серотонина, ГАМК и FMRFамида – для Ligula interrupta и ГАМК – для Diphyllobothrium dendriticum. Впервые исследованы особенности ко-локализации этих веществ в организме плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta.

Установлена регуляторная роль в отношении иммунной системы рыб выявленных в организме плероцеркоидов веществ: простагландина Е₂, серотонина и ГАМК. Впервые показано, что при воздействии этих веществ изменяются жизнеспособность и продукция реактивных форм кислорода лейкоцитами рыб. Доказано регуляторное влияние плероцеркоидов цестод на иммунную систему хозяев – рыб. Впервые установлены изменения лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб при заражении плероцеркоидами.

Нужна помощь в написании автореферата?

Мы - биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.

Цена автореферата

Показано, что инвазия плероцеркоидами цестод D. dendriticum и L. interrupta у рыб, наряду с активацией гуморального звена адаптивного иммунитета, вызывает угнетение пролиферации бластных форм лейкоцитов и супрессию клеточного звена иммунитета. Установлено, что при инвазии D. dendriticum у окончательного хозяина – сирийского хомячка – в иммунокомпетентных органах и тканях также наблюдаются противоположные процессы: активация неспецифических и специфических звеньев иммунного ответа и супрессивное влияние паразита на иммунологические реакции хозяев.

Впервые применен метод мультиплексной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции для изучения дифференциальной экспрессии иммунокомпетентных генов рыб при бактериальных заболеваниях. Впервые у радужной форели изучена динамика экспрессии провоспалительных цитокинов tnfa1, tnfa2, tnfa3, il1b1, il1b2, рецепторов этих цитокинов tnfrsf1a, tnfrsf1a-like-a, tnfrsf1a-like-b, tnfrsf9, il1r-like-1, il1r1-like-b, il1r2, il1r2-like и генов острофазных белков saa и drtp при заражении флавобактериями Flavobacterium psychrophilum.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные внесли значительный вклад в изучение адаптаций паразитов к воздействию иммунной системы их хозяев. Доказано, что плероцеркоиды цестод обладают морфологическими и биохимическими механизмами защиты от воздействия иммунной системы хозяев – рыб.

Установлено, что тегумент – место непосредственного контакта паразита с тканями хозяина – играет важную роль в защите плероцеркоидов от иммунологических реакций хозяев – рыб.

В ответ на контакт с факторами внутренней среды (сывороткой крови) хозяев – рыб в тегументе происходит усиление секреторной активности по апокриновому и мерокриновому типу, а также экскреция везикул с поверхности свободных нервных окончаний в поры тегумента. В результате образуется широкий спектр мембранно-ограниченных секреторных продуктов, потенциально содержащих иммунорегуляторные вещества.

Нами впервые начата идентификация иммунорегуляторных молекул в организме плероцеркоидов. На примере D. dendriticum впервые продемонстрировано, что плероцеркоиды секретируют простагландины Е₂ и D₂ в ответ на воздействие сыворотки крови хозяев.

Установлены возможные пути секреции этих простагландинов в ткани хозяина:

с поверхности свободных нервных окончаний в тегументе;
через протоки фронтальных желез;
выделительную систему плероцеркоидов.

На основании того факта, что у плероцеркоидов наблюдается экскреция везикул с поверхности свободных нервных окончаний при воздействии сыворотки крови хозяев, нами была выдвинута гипотеза об иммунорегуляторной роли нейроактивных субстанций, вырабатываемых плероцеркоидами.

Экспериментальными исследованиями in vitro доказана регуляторная роль в отношении иммунной системы рыб выявленных в организме плероцеркоидов веществ:

простагландина Е_2;
нейроактивных субстанций серотонина;
ГАМК.

Доказано регуляторное влияние цестод на иммунную систему промежуточных (рыб) и окончательных (сирийский хомячок) хозяев. Следовательно, иммунорегуляция присуща цестодам как на личиночной стадии развития, так и в половозрелом состоянии.

Результаты настоящего исследования имеют фундаментальное значение для более глубокого изучения тонких механизмов регуляции плероцеркоидами иммунной системы хозяина. Данная работа является первым этапом идентификации иммунорегуляторных молекул в организме плероцеркоидов, определению клеточных источников их синтеза и путей вывода в ткани хозяина, а также механизмам воздействия иммунорегуляторных веществ на иммунную систему хозяев.

Результаты работы позволяют глубже понять механизмы патогенеза при инвазии человека и животных цестодами, имеющими важное эпидемиологическое и эпизоотическое значение. Данные о тонких механизмах регуляции иммунной системы хозяина дифиллоботриидами могут быть приняты во внимание при разработке методов профилактики, диагностики и лечения гельминтозов человека и животных. Выявленные паразитарные иммунорегуляторы могут быть использованы при разработке и создании эффективных средств для лечения аутоиммунных заболеваний.

Мультидисциплинарный подход, а также набор методов с характеристиками, специально подобранными для изучения адаптации цестод к воздействию иммунной системы хозяев – рыб могут служить основой для исследования иммунологических аспектов взаимоотношений в других системах «паразит – хозяин», включая паразитарные заболевания у человека.

Результаты исследований могут быть использованы:

1. Для подготовки справочной и учебной литературы по паразитологии, иммунологии, зоологии, ихтиологии.

2. В учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий со студентами биологических, медицинских и ветеринарных факультетов высших и среднеспециальных учебных заведений.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Плероцеркоиды цестод в естественных условиях оказывают регуляторное воздействие на иммунную систему хозяев – рыб. Инвазия плероцеркоидами вызывает у рыб, с одной стороны, развитие воспалительных реакций и активацию гуморального звена адаптивного иммунитета, с другой стороны – угнетение пролиферации бластных форм лейкоцитов и супрессию клеточного звена иммунитета.

Простагландины и нейроактивные субстанции, идентифицированные в организме плероцеркоидов, изменяют жизнеспособность лейкоцитов и их способность к продукции реактивных форм кислорода в культуре лейкоцитов рыб. Эти вещества могут использоваться цестодами для регуляции иммунитета промежуточных хозяев – рыб.

2. Плероцеркоиды цестод синтезируют потенциальные иммунорегуляторы – простагландины E₂ и D₂ и секретируют эти вещества на поверхность тегумента в ответ на воздействие сыворотки крови хозяев. Возможные пути секреции этих простагландинов в ткани хозяина: с поверхности свободных нервных окончаний в тегументе, через протоки фронтальных желез и выделительную систему плероцеркоидов.

Тегумент плероцеркоидов цестод играет важную роль в их защите от иммунологических реакций хозяина. При воздействии сыворотки крови хозяев плероцеркоиды реагируют увеличением количества отдельных органоидов в дистальной цитоплазме тегумента и усилением секреторной активности на поверхности тегумента.

Апробация результатов. Результаты исследований были доложены на международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инвазионной и инфекционной патологии животных» (Улан-Удэ, 2008), международной конференции «Влияние окружающей среды на врожденный иммунитет: угроза заболеваний» (Австрия, Обергугль 2009), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы электрофизиологии и незаразной патологии животных» (Улан-Удэ, 2009), Гордоновской научной конференции по иммунохимии и иммунобиологии (Швейцария, Лес Диаблеретс, 2010), международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2010), II Международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты северной и центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011), международной научно-практической конференции «Пресноводная аквакультура Европы и Азии: реалии и перспективы развития и сотрудничества» (Улан-Удэ, 2011), XI европейском мультиколлоквиуме по паразитологии (Румыния, Клуж-Напока, 2012), III всероссийской конференции молодых ученых «Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы» (Улан-Удэ, 2013), VI всероссийской конференции с международным участием «Школа по теоретической и морской паразитологии» (Севастополь, 2016).

Публикации. Всего за период научной деятельности автором опубликовано 60 научных работ. По теме диссертации опубликовано 38 работ, из которых 15 статей – в ведущих рецензируемых журналах (список ВАК и WoS), включая 6 статей на английском языке.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, шести глав, заключения, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 462 страницах (основной текст – 267 страниц, приложение – 195 страниц), включает 171 рисунок и 18 таблиц (169 рисунков и 16 таблиц – в приложении). Список литературы содержит 476 источников, в том числе 366 – иностранных.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту Н. М. Бисеровой за критическое отношение и анализ работы, терпение, неоценимую помощь и поддержку, а также многочисленным коллегам, оказавшим помощь в получении материала, литературы, техническую поддержку исследований: всем бывшим и настоящим сотрудникам лаборатории паразитологии и экологии гидробионтов ИОЭБ СО РАН, сотруднику лаборатории медико-биологических исследований ИОЭБ СО РАН Д.Н. Оленникову, сотруднику Бурятской республиканской станции по борьбе с болезнями животных А. В. Молчанову, директору Большереченского рыборазводного завода В. Ю. Матанцеву, сотруднику Байкальского филиала Госрыбцентра А. В. Базову; сотрудникам Биологического факультета МГУ: коллективу кафедры зоологии беспозвоночных, О.П. Ильинской, И. А. Демьяненко (кафедра клеточной биологии и гистологии), И. А. Кондратьевой, Д. Б. Киселевскому (кафедра иммунологии); сотрудникам ИБВВ РАН Ж. В. Корневой, В. Р. Микрякову, Д. В. Микрякову, Л. В. Балабановой, Е. А. Заботкиной, коллективу лаборатории молекулярных механизмов патологических процессов ИЦиГ СО РАН во главе с В. А. Мордвиновым.

Особую благодарность автор выражает сотрудникам кабинета электронной микроскопии ИБВВ РАН во главе с С. И. Метелевым, коллективу лаборатории конфокальной микроскопии Биологического факультета МГУ во главе с М. М. Мойсеновичем, сотруднику ИБР РАН Е. Б. Цитрину, сотруднику межкафедральной лаборатории электронной микроскопии МГУ А. Г. Богданову. Автор глубоко признателен своим зарубежным коллегам за идейную и методическую поддержку исследований: коллективу группы эволюционной экологии животных университета г. Мюнстер, Германия во главе с Й. Куртцем, сотрудникам Национального центра прохладно- и холодноводной аквакультуры, США Г. Уайенсу, Б. Кливленд, Т. Лидсу, Д. Карену.

Нужна помощь в написании автореферата?

Заказать автореферат

Работа выполнена при поддержке грантов Фулбрайта (68140211), ДААД (A/11/04242), РФФИ (08-04-98035, 09-04-01056, 09-04-90767, 10-04-09260, 10-04-90750, 12-04-98002, 12-04-98003, 12-04-90731, 13-04-90702, 16-04-01213), OPTEC Group (2012 г.), Бурятского государственного университета (2006, 2007 гг.).

1. История изучения иммунологических аспектов взаимоотношений в системах «паразит – хозяин»

В первой главе приведен обзор основных публикаций, касающихся реакций иммунной системы хозяев в ответ на инвазию паразитов, а также адаптивных механизмов паразитов, направленных на защиту от иммунного ответа хозяев.

Анализ данных литературы показал, что адаптивные механизмы паразитов, применяемые ими для защиты от иммунного ответа хозяев, были изучены, главным образом, у паразитов, имеющих медицинское и ветеринарное значение с использованием в моделях половозрелых стадий паразитов и млекопитающих в качестве хозяев.

Исследования проводились, главным образом, на представителях трематод и нематод. Адаптации паразитов были исследованы, главным образом, биохимическими методами.

Микроморфологические исследования — реализации этих механизмов у паразитов, включая цестод, почти полностью отсутствуют. Данных литературы о локализации иммунорегуляторных молекул в организме паразитов чрезвычайно мало. Механизмы защиты плероцеркоидов цестод от иммунной системы рыб не изучены совершенно.

Спектр иммунорегуляторных молекул цестод также остается мало исследованным. До сих пор неизвестно, какие типы клеток у цестод продуцируют иммунорегуляторные молекулы. Не известно воздействие отдельных иммунорегуляторных молекул цестод на иммунную систему рыб. Не смотря на наличие данных по изменению показателей иммунной системы рыб при инвазии цестодами, остается неясным вклад иммунорегуляторного влияния цестод в эти изменения.

2. Материалы и методы

Во второй главе подробно описаны объекты исследования, методологические подходы и методы, использованные при проведении исследований.

Материалы для исследований. Основными объектами исследования выбраны системы паразит – хозяин: «лентец чаечный Diphyllobothrium dendriticum – байкальский омуль Coregonus migratorius» и «ремнец Ligula interrupta – карась серебряный Carassius gibelio». Байкальский омуль отлавливался из оз. Байкал в Кабанском районе Республики Бурятия. Карась серебряный отлавливался из оз. Долгое Еравнинского района Республики Бурятия. Плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta извлекали из полости тела их хозяев (байкальского омуля и карася серебряного, соответственно).

Изучение влияния потенциальных регуляторов иммунной системы на показатели лейкоцитов рыб было проведено с использованием трехиглой колюшки Gasterosteus aculeatus и ремнецов Schistocephalus solidus. Исследование иммунологических реакций окончательных хозяев в ответ на инвазию цестодами проводилось при экспериментальном заражении сирийского хомячка Mesocricetus auratus плероцеркоидами D. dendriticum. Иммунологические реакции рыб в ответ на заражение патогенными бактериями были изучены при заражении радужной форели Oncorhynchus mykiss флавобактериями Flavobacterium psychrophilum.

Инкубирование плероцеркоидов цестод. Плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta помещали в инкубационную среду, включающую раствор Хенкса и сыворотку крови хозяев в соотношении 1:1, пенициллин 10⁵ МЕ/л, линкомицин 100 мг/л (Давыдов, Микряков, 1988; Kutyrev et al., 2014). Инкубацию проводили при 4^°С в течение 3, 6, 12, 24 ч. В каждом эксперименте было использовано по 5 плероцеркоидов каждого вида. Плероцеркоиды фиксировались в 2,5 % глутаральдегиде на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) для сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии. Для биохимических исследований среда, в которой инкубировались плероцеркоиды, фиксировались жидким азотом.

Сканирующая электронная микроскопия. Плероцеркоидов обезвоживали в спиртах и ацетоне, высушивали в аппарате сушки в критической точке, затем наклеивали на специальные столики, напыляли смесью тяжелых металлов платина–палладий и просматривали в сканирующих электронных микроскопах Jeol JSM, CamScan (Бисерова, 2013).

На изготовленных микрофотографиях производили подсчет оформленных выходов секреторных продуктов на поверхности плероцеркоидов. Пересчет производили на единицу площади, занимаемой телом плероцеркоидов на фотоснимках. Кроме того, измеряли длину большой и малой осей оформленных выходов секрета (для удобства именуемые «длиной» и «шириной»). Промеряли размеры не менее 400 структур и подсчитывали не менее 2500 структур для каждого эксперимента (Автандилов, 1990). Интенсивность неоформленных выходов секрета измеряли полуколичественным методом.

Трансмиссионная электронная микроскопия. После отмывки в фосфатном буфере материал был дофиксирован 1 %-ным раствором четырехокиси осмия и сохранен в 70 %-ом этаноле. Затем по стандартной методике материал был заключен в смесь аралдитов, ультратомирован, полученные срезы были окрашены и просмотрены под трансмиссионными электронными микроскопами Jem 100B, Jem-1011 (Бисерова, 2013). На изготовленных микрофотографиях проводили подсчет органоидов дистальной цитоплазмы тегумента плероцеркоидов. Подсчет проводили на условной единице площади 1 мкм², занимаемой прямоугольной областью, ограниченной с двух сторон внешней и внутренней мембранами цитоплазмы. Промеряли размеры не менее 400 органоидов и подсчитывали не менее 2500 органоидов для каждого эксперимента (Автандилов, 1990).

Иммуцитохимическое выявление иммунорегуляторов. Для выявления и изучения распределения иммунорегуляторных молекул в организме плероцеркоидов использовали методы иммуноцитохимического окрашивания тканей (Immunochemical Staining Methods, 2001) с применением новейших методик (Бисерова, 2013) и специально разработанных оригинальных прописей для выявления простагландинов.

Материал фиксировали в 4 %-ном параформе на 0,1 М фосфатном буфере (PBS), pH 7,4, отмывали в 0,1 М PBS и помещали в 10 %- ный раствор сахарозы на 0,1 М PBS. Часть плероцеркоидов не фиксировали, а сразу после выделения замораживали в жидком азоте для определения PGЕ₂ и PGD₂. Перед резкой объекты помещали в криопротектор Tissue-Tek (Sakura Finetek, USA), после чего резали на криотоме Leica CM 1850 UV (Германия). Срезы (8–10 мкм) помещали на предметные стекла с поли-L-лизином. Для выявления PGЕ₂ и PGD₂ срезы фиксировали в абсолютном ацетоне. После высушивания срезов проводили инкубацию с антителами к PGЕ₂ (Abcam, Великобритания), PGD₂ (LifeSpan BioSciences, США), 5-HT, ГАМК, нейропептиду FMRFамиду, α-тубулину (Sigma, США), а затем – со вторичными антителами Alexa 405, 488, 532, 635 (Invitrogen, США), конъюгированными с флуорохромами. Готовые препараты исследовали с помощью флуоресцентных микроскопов Axioscope Carl Zeiss (Германия) и Axioscope Opton (Германия), лазерных сканирующих конфокальных микроскопов LSM-510 Meta (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany) и Leica TSC SPE (Германия).

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Плероцеркоиды D. dendriticum, непосредственно извлеченные из омуля, а также содержащая сыворотку крови омуля среда, в которой инкубировались паразиты, были заморожены и хранились в жидком азоте. Простагландины экстрагировали из образцов (Fast et al., 2004). Идентификация и количественная оценка простагландинов Е₂ и D₂ была проведена методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) c ультрафиолетовым детектированием с использованием системы МилиХром А-02 (Эконова, Россия). Для более точной идентификации простагландинов в организме был применен метод масс-спектрометрического анализа с использованием время-пролетного масс-спектрометра Agilent 6200 TOF LC/MS (Agilent Technologies, США) с ионизацией электрораспылением.

Исследование in vitro влияния иммунорегуляторов на лейкоциты рыб. Трехиглые колюшки были выращены в аквариальных условиях в университете г. Мюнстер (Германия).

Для приготовления культуральной среды в разбавленную среду Leibovitz 15 (Thermo Fisher Scientific, США) добавляли 10⁵ МЕ/л пенициллина, 100 мг/л стрептомицина, 4 ммоль/л L-глутамина, 5 % (по объему) эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Sigma Aldrich) и 2 % (по объему) сыворотки карпа. Суспензия клеток из головной почки приготовлялась продавливанием тканей через нейлоновое сито с диаметром ячеек 40 мкм (BD-Falcon, США). Изолированные лейкоциты головной почки (ЛГП) были промыты, центрифугированы и ресуспендированы в культуральной среде.

От каждой особи трехиглой колюшки был приготовлен ряд культур клеток, позволяющий протестировать влияние различных веществ/концентраций веществ на одну и ту же особь. ЛГП инкубировались в 96-луночных плоскодонных планшетах с лунками малой емкости (10⁵ клеток на лунку в конечном объеме 100 мкл). PGE₂ добавляли в конечных концентрациях 0,1 мкмоль/л, 0,1 нмоль/л, 0,1 пмоль/л. Серотонин добавляли в конечных концентрациях 10, 1, 0,1 пмоль/л. ГАМК добавляли в конечных концентрациях 100, 10, 1 нмоль/л. Контрольные культуры инкубировались только в культуральной среде. Культуры клеток инкубировались в течение 2 ч и 4 сут в насыщенной водяными парами атмосфере при постоянной концентрации CO₂ – 3 %.

Подсчет абсолютного количества живых лейкоцитов, а также субпопуляций гранулоцитов и лимфоцитов проводился методом проточной цитофлуориметрии (Pechhold et al., 1994; Scharsack et al., 2004) при помощи проточного цитофлуориметра FACS Canto II (BD, США). Измерение продукции реактивных форм кислорода лейкоцитами проводили методом люцигенин-зависимой хемилюминисценции (Scott, Klesius, 1981; Kurtz et al., 2004) при помощи многорежимного планшет-ридера Tecan Infinite 200 (Tecan, Switzerland).

Исследование лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб. Для исследований были взяты отпечатки головной и туловищной почек, селезенки особей байкальского омуля, зараженных и незараженных D. dendriticum, а также особей карася серебряного, зараженных и незараженных L. interrupta. Отпечатки окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимза (Меркулов, 1969; Микроскопическая техника, 1996). Дифференцировку клеток лейкоцитарного ряда проводили согласно классификации Ивановой (1983). Подсчет клеток производили при помощи светового микроскопа MC-300 (Micros, Австрия) при увеличении в 1350 раз. Для каждой группы рыб (контроль и зараженные) был произведен подсчет по 3000 клеток.

Исследование гистоморфологии иммунокомпетентных органов и тканей окончательного хозяина. Сирийские хомячки были заражены перорально живыми плероцеркоидами лентеца чаечного, полученными от байкальского омуля. От контрольных и зараженных животных были взяты кусочки органов и зафиксировали 10 %-ным нейтральным формалином. Клеточный состав брыжеечных лимфатических узлов и 12-перстной кишки изучали на парафиновых срезах толщиной 4–6 мкм, окрашенных азур-эозином, метиловым зеленым — пиронином по Браше в модификации Курника, толуидиновым синим (Меркулов, 1969; Микроскопическая техника, 1996) при помощи микроскопа Micros МС-300А (Micros, Австрия).

Исследование экспрессии иммунокомпетентных генов рыб. Для исследований использовали радужную форель, содержавшуюся в Национальном центре прохладно- и холодноводной аквакультуры (Западная Вирджиния, США). Рыбам интраперитонеально делали инъекции по 50 мкл либо PBS (контроль), либо PBS, содержащего 2,3 ± 0,4 x 10⁸ КОЕ F. psychrophilum (Fp) штамма CSF259-93 (зараженные рыбы) (Wiens et al., 2014). Через 6, 24, 48 и 144 ч после заражения рыбы были анестезированы с использованием трикаин-метансульфоната (Western Chemical, США). Образцы селезенки были заморожены в жидком азоте.

ДНК экстрагировали при помощи набора DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). Для амплификации использовали термоциклер для ПЦР в реальном времени ABI 7900HT (Applied Biosystems) (Marancik, Wiens, 2013). РНК выделяли реагентом TRIzol (Invitrogen, США) согласно инструкции производителя. Для количественной оценки уровня транскрипции генов нами был использован секвенатор GenomeLab (Beckman Coulter, США) с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. В мультиплексной ПЦР 21 пара праймеров амплифицировала гены, связанные с иммунологическим ответом рыб, и 4 пары праймеров были использованы для амплификации референсных генов.

3. Микроморфологические изменения цестод при воздействии сыворотки крови их хозяев

В первой части главы приведены накопленные к началу исследования данные по микроморфологии тегумента цестод, а также немногочисленные сведения по изучению микроморфологических адаптаций цестод к воздействию иммунной системы их хозяев. Только единичные работы были посвящены реакции цестод на воздействие иммунных комплексов их хозяев. Показано, что при инкубации половозрелых Eubothrium rugosum и Bothriocephalus acheilognathi в сыворотке крови хозяина и имплантации в полость тела хозяев – рыб происходит усиление функционирования железистых клеток (Давыдов, 1981; Давыдов, Микряков, 1988).

Сведения о микроморфологических особенностях адаптации плероцеркоидов цестод к воздействию иммунной системы хозяев рыб к началу нашей работы отсутствовали. Опираясь на имеющиеся данные, нами была выдвинута гипотеза о важной роли тегумента в защите плероцеркоидов от иммунной системы их хозяев – рыб. На первом этапе проведено морфометрическое исследование секреторной активности и изменений ультраструктуры тегумента плероцеркоидов в ответ на инкубацию с сывороткой крови хозяев.

Осуществлен сравнительный анализ морфометрических данных у двух видов плероцеркоидов, имеющих различную локализацию в организме рыб:

D. dendriticum (локализуется в тканях рыб в инкапсулированном состоянии) и L. interrupta (обитает свободно в полости тела).

Особенности выведения секрета на поверхность тегумента плероцеркоидов при воздействии сыворотки крови хозяев. У D. dendriticum сколекс отчетливо отделен от тела, шаровидный. У L. interrupta типичного сколекса нет. Его функцию выполняет передний конец тела, на котором находятся ботрии. При исследовании поверхности тегумента плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta нами были обнаружены выходы секреторных продуктов. У D. dendriticum выявлены выросты секрета двух типов. Первый тип представляет собой небольшие выпячивания, имеющие определенную форму: шаровидные, конусовидные, продолговатые, грибовидные и т. д. Количество оформленных выходов секрета на сколексе почти в 10 раз превышает их количество на теле. Второй тип секреторных продуктов не имел определенной формы и сплошной массой заполнял складки тела. У L. interrupta был обнаружен только один тип выходов секрета – оформленный.

В ответ на воздействие сыворотки крови хозяев на поверхности тегумента плероцеркоидов наблюдалось увеличение количества вышедших секреторных продуктов. Количество оформленных секреторных выростов увеличивается у обоих видов плероцеркоидов. У D. dendriticum максимум выхода оформленных секреторных продуктов наблюдается через 6 ч после начала инкубации, их количество увеличивается в 5 раз как на сколексе, так и на теле.

У interrupta максимальный выход оформленного секрета наблюдается с 6 по 12 ч после начала инкубации, количество выростов увеличивается почти в 50 раз. Интенсивность секреции при воздействии сыворотки крови у L. interrupta значительно выше, чем у D. dendriticum. Максимальные значения количества железистых выростов на теле у L. interrupta (6 ч инкубации) превышают максимальные значения у D. dendriticum в теле (6 ч) более чем в 50 раз.

В сколексе D. dendriticum при инкубации количество сплошных выходов секрета значительно не изменяется. Вероятно, в сколексе большую роль играют оформленные выходы секрета, число которых через 6 ч инкубации возрастает в 5 раз. На теле же количество оформленных выходов секрета, хотя и возрастает через 6 ч инкубации также в 5 раз, тем не менее, остается в 9 раз ниже, чем в сколексе. В то же время, интенсивность выхода сплошных выходов секрета в складках тела через 12 ч инкубации возрастает почти в 18 раз.

Нужна помощь в написании автореферата?

Подробнее

Изменения ультраструктуры тегумента плероцеркоидов при воздействии сыворотки крови хозяев. Для изучения тонких механизмов секреции в тегументе плероцеркоидов нами на ультратонких срезах была исследована динамика морфологических изменений тегумента при воздействии сыворотки крови хозяев. Обнаруженное с помощью СЭМ усиление секреторной активности на поверхности тела плероцеркоидов при воздействии сыворотки крови хозяев подтверждается данными ТЭМ. На срезах плероцеркоидов наблюдаются процессы экзосекреции с поверхности наружной мембраны дистальной цитоплазмы.

Отмечены следующие способы секреции:

1. Апокриновый, характерный как для D. dendriticum, так и L. interrupta (Рисунок 3). При этом способе формируются выросты цитоплазмы средней электронной плотности с гомогенным содержимым, не содержащим органоидов. В дальнейшем выросты отшнуровываются и выходят в окружающую среду.

2. Мерокриновый, выявленный у D. dendriticum (Рисунок 4). Осуществляется путем выхода содержимого вакуолей через наружную мембрану дистальной цитоплазмы в окружающую среду.

3. Выход везикул из свободных нервных окончаний через наружную мембрану дистальной цитоплазмы в поры тегумента (Рисунок 5). Этот способ секреции характерен как для D. dendriticum, так и L. interrupta.

В дистальной цитоплазме плероцеркоидов наблюдается увеличение количества отдельных органоидов в ответ на инкубацию с сывороткой крови. Как у плероцеркоидов D. dendriticum, так и L. interrupta значительно увеличивается абсолютное и относительное количество палочковидных гранул. У D. dendriticum важную роль в ответной реакции играют дисковидные тела. В процессе инкубации увеличивается абсолютное количество дисковидных тел в дистальной цитоплазме как сколекса, так и тела, относительное количество и размеры – в сколексе плероцеркоидов.

В процессе инкубации дисковидные тела становятся более электронно-светлыми, распределяются по всей толщине дистальной цитоплазмы, в отличие от контрольных особей, у которых эти органоиды сосредоточены у наружной мембраны дистальной цитоплазмы. У L. interrupta, наоборот, количество и размеры дисковидных тел уменьшаются в процессе инкубации. В защитных реакциях принимают участие другие органоиды цитоплазмы: везикулы и вакуоли. Везикулы отсутствуют в дистальной цитоплазме тегумента контрольных плероцеркоидов, появляются уже через 3 часа после начала инкубации и сохраняются на всем протяжении инкубации. Вакуоли появляются через 6 часов и наблюдаются до 12 часов после начала инкубации. Они достигают значительных размеров – до 3,6 мкм.

В последние годы было выявлено, что экскреторно-секреторные продукты, выделяемые гельминтами в область контакта тканей паразита и хозяина, могут выводиться либо в виде растворимой фракции, либо в виде мембранно-ограниченных внеклеточных везикул, включая экзосомы. Внеклеточные везикулы являются механизмом передачи информации между клетками и организмами, широко распространенным в живой природе. Вырабатываемые паразитами внеклеточные везикулы способны передавать информацию и переносить генетический материал к клеткам хозяина или другим паразитам (Marcilla et al., 2012; Buck et al., 2014; Coakley et al., 2015, 2016).

Нашими исследованиями впервые для цестод была показана способность в ответ на стимуляцию сывороткой крови хозяев секретировать широкий спектр мембранно- ограниченных везикул размером до 170 нм и секреторных тел размером до 19 мкм. Обнаруженные секреторные продукты являются потенциальными транспортерами иммунорегуляторных молекул от организма паразита к организму хозяина. До начала наших исследований отсутствовали сведения о спектре иммунорегуляторных молекул и биохимическом составе экскреторно- секреторных продуктов цестод.

Следующая глава посвящена идентификации отдельных иммунорегуляторных молекул и их распределению в организме плероцеркоидов, а также выявлению секреции отдельных иммунорегуляторных веществ плероцеркоидами в ответ на воздействие сывороткой крови хозяев.

4. Выработка и распределение иммунорегуляторных молекул в организме цестод, паразитирующих в рыбах

Нами была выдвинута гипотеза о том, что простагландины и нейроактивные субстанции вырабатываются в организме плероцеркоидов цестод с целью регуляции иммунитета своих хозяев – рыб. В первом разделе главы приводятся данные по иммунорегуляторным молекулам паразитов. Простагландины, синтезируемые паразитами, являются одним из важных классов регуляторов иммунной системы хозяев (Kubata et al., 2007).

Нейроактивные субстанции также способны оказывать иммунорегулирующее действие (Kawli et al., 2010). Нервные клетки гельминтов способны синтезировать широкий спектр молекул, идентичных функционирующим в организме хозяина, и, таким образом, потенциально могут управлять жизнедеятельностью хозяина, в частности его иммунными реакциями и поведением (Barber, Scharsack, 2010). Иммунорегуляторы паразитов исследовались, почти исключительно, биохимическими методами.

Данные о локализации иммунорегуляторных молекул в организме паразитов были представлены только в одном исследовании, посвященном распределению простагландина Е₂ в организме нематоды Onchocerca volvulus (Brattig et al., 2006). Иммунорегуляторы были исследованы, главным образом, у трематод и нематод (Jenkins, 2005; Hewitson, 2009; Balic, 2004). Информации об иммунорегуляторах в классе Cestoda крайне мало, до начала наших исследований существовала единственная работа, посвященная влиянию экскреторно-секреторных экстрактов цестод на иммунитет мышей, в результате которого происходит супрессия Th1 – иммунного ответа (Terrazas, 1998).

Распределение простагландинов Е₂ и D₂ (PGЕ₂ и PGD₂) в организме D. dendriticum и L. interrupta. Впервые у цестод была исследована микроанатомия PGE₂-иммунореактивных (ИР) структур. PGE₂-ИР области были выявлены в центральном и периферическом отделах нервной системы плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta. PGE₂ локализован в периферической цитоплазме нейронов главного нервного ствола и выходящих из него нервов, ядерная зона была негативно окрашена на PGE₂. Кроме того, позитивная иммунореакция на PGE₂ выявлена в отростках нейронов в нейропиле. Проведенные нами ультраструктурные исследования нервной системы плероцеркоидов позволяют предположить, что именно малые нейроны в кортикальном слое главного нервного ствола проявляют позитивную иммунологическую реакцию на PGE_2.

PGE₂-ИР участки были выявлены также на поверхности тегумента плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta. Они были округлой, овальной или неправильной формы. Двойное окрашивание на PGE₂ и α-тубулин выявило ко-локализацию большинства PGE₂-ИР участков с сенсорными отростками нейронов (рецепторами) или протоками желез. В этом случае PGE₂— ИР участки располагались на терминальных расширениях сенсорных отростков (сенсилл) или протоков желез. Остальные PGE₂-ИР участки не были связаны с α- тубулин-позитивными элементами.

Сходным образом, не все сенсорные отростки или протоки желез проявляли ко-локализацию с PGE₂-ИР участками. Электронно- микроскопическое исследование выявило тесное расположение сенсилл и протоков желез в тегументе плероцеркоидов. В предыдущей главе было доказано участие сенсорных отростков плероцеркоидов в секреторных процессах.

Интенсивная PGE₂-ИР была выявлена в терминальных клетках протонефридий (циртоцитах) плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta; клетки были расположены в кортикальной паренхиме и периферической части медуллярной паренхимы. Циртоциты имели продолговатую конусовидную форму с заостряющейся вершиной и закругленным основанием.

Наиболее интенсивное окрашивание на PGE₂ наблюдалось в основании конуса. Ультраструктурное исследование циртоцитов выявило, что интенсивно окрашенные PGE₂-ИР участки в основании конуса соответствовали слою цитоплазмы вокруг ядра. Слабо окрашенные PGE₂-ИР области соответствовали цитоплазме вокруг пучка ресничек.

У L. interrupta, кроме того, интенсивная иммунная реакция на PGE₂ выявлена в цитонах тегумента. Эти участки имеют округлую или овальную форму. Интенсивное окрашивание на PGE₂ выявлено в зоне перикариона тегументальных клеток; ядерная зона негативно окрашена на PGE₂.

Нужна помощь в написании автореферата?

Заказать автореферат

Бóльшая часть PGD₂-позитивных участков была связана с мышечными клетками. PGD₂-ИР была выявлена в кольцевых и продольных субтегументальных мышечных волокнах. Интенсивная PGD₂-ИР наблюдалась в продольных мышечных волокнах в паренхиме. Двойное окрашивание на PGD₂ и фаллоидин выявило наложение PGD₂-ИР и фаллоидин-позитивных участков.

Окрашивание на PGD₂ было неоднородным: один конец продольных мышечных волокон был окрашен более интенсивно, чем другой и соответствовал ядерной саркоплазматической части клетки. Дорзовентральные и поперечные мышечные волокна в центральной части тела также имели PGD₂-ИР. Кроме того, PGD₂— позитивные участки были обнаружены в циртоцитах. Распределение PGD₂-ИР в циртоцитах было сходным с распределением PGE₂: более интенсивно окрашивался участок цитоплазмы вокруг ядра, менее интенсивно – цитоплазма вокруг пучка ресничек.

Таким образом, иммунорегуляторы PGЕ₂ и PGD₂ могут выделяться плероцеркоидами в ткани хозяина с поверхности свободных нервных окончаний и через протоки фронтальных желез в тегументе, а также выделительную систему.

Выработка PGЕ₂ и PGD₂ в организме D. dendriticum. Впервые в организме плероцеркоидов цестод методом ВЭЖХ была определена концентрация простагландинов E₂ и D₂ (Рисунок 9). Концентрация PGE₂ в гомогенатах плероцеркоидов варьировала от 24,74 до 45,73 нг·мг^-1 в перерасчете на вес сырой ткани со средним значением 33,15 нг·мг^-1. Варьирование концентрации PGD₂ было в пределах от 0,84 до 3,14 нг·мг^-1 со средним значением 1,94 нг·мг^-1.

Для более глубокого понимания роли простагландинов во взаимоотношениях цестод и их хозяев – рыб мы инкубировали плероцеркоиды D. dendriticum в среде, содержащей сыворотку крови своего хозяина – байкальского омуля. Используя метод ВЭЖХ, было доказано, что плероцеркоиды D. dendriticum под воздействием сыворотки крови своего хозяина продуцируют простагландины E₂ и D₂ и секретируют их в инкубационную среду. Максимальная концентрация PGE₂ и PGD₂ в культуральной среде наблюдалась после 12 ч инкубирования.

Распределение нейроактивных субстанций в организме D. dendriticum и L. interrupta. В нервной системе D. dendriticum и L. interrupta исследовано распределение нейроактивных субстанций, потенциальных нейро- и иммунорегуляторов: γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), серотонина (5-HT), нейропептида FMRFамида. Впервые исследована иммуноцитохимическая организация нервной системы L. interrupta. Впервые описано распределение ГАМК в нервной системе D. dendriticum и L. interrupta.

В центральной нервной системе плероцеркоидов ГАМК-ИР элементы выявлены в церебральном ганглии и главных нервных стволах, где они расположены как в нейропиле, так и в отходящих отростках. В периферической нервной системе интенсивная ГАМК-ИР была выявлена на поверхности субтегументальных мышц и на слое продольной мускулатуры тела, дорзовентральных и поперечных мышцах центральной паренхимы.

Тела серотонинергических нейронов были найдены в центральной нервной системе: как в ганглиях, так и в главных нервных стволах. Эти нейроны занимают латеральную позицию, их отростки проходят в дорзальном и вентральном направлениях. Интенсивная 5-HT-ИР была выявлена в нервных отростках на дистальной поверхности слоя продольных мышц.

FMRFамидергические элементы в центральной нервной системе плероцеркоидов занимают противоположную позицию серотонинергическому компартменту, располагаясь проксимально от центрального нейропиля.

Интенсивная FMRFамид-ИР была выявлена в периферической нервной системе и была связана с иннервацией продольной мускулатуры тела, а также дорзо- вентральных и продольных мышечных волокон.

5. Регуляторное влияние цестод на иммунную систему хозяев – рыб

Первый раздел главы посвящен накопленным к началу исследований данным по строению, механизмам функционирования иммунной системы рыб и иммунному ответу рыб при инфекциях и паразитозах. Большинство публикаций посвящено исследованию иммунного ответа рыб на инвазию одноклеточными паразитами; из Metazoa в этом плане наиболее изучено влияние трематод и нематод. Влиянию цестод посвящены немногочисленные работы.

Исследования микроморфологии органов иммунной системы рыб при инвазии паразитами отсутствуют. При идентификации иммунокомпетентных клеток рыб использовались упрощенные классификации. Несмотря на наличие данных по изменению показателей иммунной системы рыб при инвазии цестодами, оставался неясным вклад иммунорегуляторного влияния цестод в эти изменения. Не известно воздействие отдельных иммунорегуляторных молекул цестод на иммунную систему рыб.

В связи с этим, в настоящей работе нами проведены исследования регуляторного влияния цестод на иммунную систему рыб. Во- первых, изучено влияние выявленных в организме D. dendriticum и L. interrupta иммунорегуляторных молекул – простагландинов и нейроактивных субстанций – на иммунную систему рыб in vitro. Во-вторых, проведен комплексный анализ изменений лейкоцитарного состава органов иммунной системы байкальского омуля и карася серебряного при инвазии D. dendriticum и L. interrupta, соответственно.

Влияние in vitro потенциальных иммунорегуляторных молекул цестод на показатели лейкоцитов трехиглой колюшки Gasterosteus aculeatus. Для изучения роли в регуляции иммунитета хозяев – рыб выявленных нами у плероцеркоидов цестод простагландинов и нейромедиаторов нами была проведена серия экспериментальных работ in vitro. Для этой цели было использовано культивирование лейкоцитов трехиглой колюшки Gasterosteus aculeatus. Проведенные исследования позволили установить, что выявленные в организме цестод D. dendriticum и L. interrupta простагландин E₂ и нейроактивные субстанции серотонин и ГАМК обладают выраженными регуляторными свойствами в отношении иммунитета рыб.

В краткосрочных культурах (2 ч) PGE₂ не вызывал изменения числа живых лейкоцитов, но подавлял продукцию лейкоцитами реактивных форм кислорода. Наиболее выраженное влияние PGE₂ наблюдалось в долгосрочных (96 ч) клеточных культурах. Наибольшая концентрация PGE₂, протестированная нами – 0,1 мкмоль/л – вызывает значительное снижение жизнеспособности лейкоцитов. В противоположность этому, средние (0,1 нмоль/л) и низкие (0,1 пмоль/л) концентрации PGE₂ вызывают повышение жизнеспособности лейкоцитов, по сравнению с контролем. В то же самое время, индекс соотношения гранулоцитов и лейкоцитов (Г/Л) увеличивается под влиянием PGE₂. Увеличение Г/Л-индекса могло быть вызвано дифференциальной восприимчивостью различных типов клеток к воздействию PGE₂: гранулоциты, вероятно, были менее восприимчивыми к цитотоксическому эффекту.

Установлено, что концентрация PGE₂ в организме плероцеркоидов D. dendriticum (см. главу 4) соответствует максимальной концентрации PGE₂, использованной для экспериментов in vitro. Предполагается, что PGЕ₂, секретируемый плероцеркоидами D. dendriticum в ткани хозяев, может вызывать супрессию иммунного ответа этих хозяев.

В краткосрочной культуре серотонин не изменяет жизнеспособности лейкоцитов и Г/Л-индекса, однако во всех исследованных концентрациях серотонин снижает продукцию реактивных форм кислорода лейкоцитами. В долгосрочной культуре воздействие высоких концентраций (10 пмоль/л) серотонина вызывает снижение жизнеспособности лейкоцитов, не изменяя при этом Г/Л-индекс. Кислородный взрыв, наоборот, усиливается, при воздействии как высоких, так средних (1 пмоль/л) и низких (0,1 пмоль/л) концентраций серотонина.

В краткосрочной культуре ГАМК не изменяет жизнеспособности лейкоцитов и Г/Л-индекса, однако в концентрациях 100 и 10 нмоль/л ГАМК снижает продукцию реактивных форм кислорода лейкоцитами. В долгосрочной культуре воздействие высоких и средних концентраций (100 нмоль/л и 10 нмоль/л) ГАМК вызывает увеличение жизнеспособности ЛГП; при этом Г/Л- индекс и кислородный взрыв увеличиваются под воздействием всех исследованных концентраций.

Таким образом, серотонин и ГАМК оказывают разнонаправленное действие на культуру лейкоцитов рыб, в зависимости от продолжительности воздействия и концентраций. Наши данные подтверждают, что эти нейроактивные субстанции, секретируемые цестодами, являются иммунорегуляторами и могут участвовать в регуляции иммунитета их хозяев.

Нужна помощь в написании автореферата?

Заказать автореферат

Изменение лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб при заражении плероцеркоидами цестод. Для исследования регулирующего влияния цестод на антипаразитарный иммунологический ответ хозяев – рыб in vivo были использованы две паразито-хозяинные системы: «D. dendriticum – С. migratorius» и «L. interrupta – С. gibelio». Исследовали лейкоцитарный состав органов иммунной системы рыб (головного и туловищного отделов почки, селезенки) у рыб, не зараженных и зараженных цестодами.

Установлено, что инвазия плероцеркоидами вызывает у рыб развитие воспалительных реакций. В головной почке байкальского омуля наблюдается увеличение общего количества нейтрофилов, происходит миграция нейтрофилов из головной почки и селезенки в кровеносное русло и далее – к месту формирования капсулы. У байкальского омуля при инвазии D. dendriticum в результате воспалительной реакции формируется капсула вокруг паразитов. Напротив, у серебряного карася, зараженного плероцеркоидами L. interrupta, капсула вокруг паразитов не формируется, однако количество нейтрофилов в туловищном отделе почки и селезенке увеличивается. Нейтрофилы в организме карася, вероятно, участвуют в удалении продуктов метаболизма плероцеркоидов L. interrupta и тканей рыб, поврежденных в результате роста паразитов.

Наряду с усилением неспецифического и специфического иммунного ответа, в организме рыб при инвазии плероцеркоидами наблюдаются иммуносупрессивные явления. D. dendriticum вызывает супрессию клеточного звена адаптивного иммунитета байкальского омуля. При лигулезе в организме карася серебряного уменьшается интенсивность пролиферации бластных форм лейкоцитов, а также псевдобазофилов и псевдоэозинофилов, играющих важнейшую роль в развитии реакций цитотоксичности для уничтожения паразитов.

Микроморфологические изменения органов, принимающих участие в антипаразитарном иммунологическом ответе, при экспериментальном заражении окончательных хозяев цестодами. Проведен сравнительный анализ иммунологических реакций промежуточных (байкальский омуль) и окончательных (сирийский хомячок) хозяев при инвазии D. dendriticum. При исследовании изменений иммунокомпетентных органов и тканей хомяков, зараженных D. dendriticum наблюдались две составляющие: активация неспецифических и специфических звеньев иммунного ответа и супрессивное влияние паразита на иммунологические реакции хозяев. Таким образом, D. dendriticum регулирует иммунный ответ хозяев как на стадии плероцеркоида, так и в половозрелом состоянии.

Изменение экспрессии иммунокомпетентных генов у радужной форели Oncorhynchus mykiss при заражении флавобактериями Flavobacterium psychrophilum. Анализ иммунологических реакций радужной форели при заражении патогенными бактериями F. psychrophilum выявил дифференциальную регуляцию экспресии провоспалительных цитокинов tnfa1, tnfa2, tnfa3, il1b1, il1b2, il11a, их рецепторов tnfrsf1a, tnfrsf1a-like-a, tnfrsf1a-like-b, tnfrsf9, il1r-like-1, il1r1-like-b, il1r2 и острофазных белков saa и drtp. Показано, что патогенные бактерии, в отличие от цестод, не оказывают регуляторного влияния на иммунный ответ рыб.

6. Анализ иммунологических аспектов взаимоотношений в системах «цестоды – рыбы»

В данной главе проводится анализ полученных данных, обсуждается значимость выявленных аспектов механизмов по защите паразитов от иммунной системы хозяев для систем паразит-хозяин: D. dendriticum – C. migratorius и L. interrupta – C. gibelio.

Проведенные нами исследования показали, что тегумент плероцеркоидов цестод играют важную роль в адаптационных механизмах, необходимых для защиты паразитов от иммунной системы их хозяев – рыб. Плероцеркоиды D. dendriticum и L. interrupta отвечают усилением выведения секреторных продуктов в окружающую среду в ответ на воздействие сыворотки крови хозяев. Интенсивность секреции у L. interrupta была значительно выше, чем у D. dendriticum, секреторные продукты имели большие размеры.

Нашими исследованиями впервые было показано, что цестоды способны в ответ на стимуляцию сывороткой крови их хозяев секретировать широкий спектр мембранно-ограниченных секреторных тел и везикул. Обнаруженные секреторные продукты, по последним данным, являются потенциальными транспортерами иммунорегуляторных молекул от организма паразита к организму хозяина.

Для идентификации потенциальных иммунорегуляторных молекул в организме плероцеркоидов проведен ряд иммуноцитохимических и биохимических исследований. Были определены микроморфологические особенности распределения в организме потенциальных иммунорегуляторов из групп простагландинов (PGE₂ и PGD₂) и нейроактивных субстанций (серотонина, γ-аминомасляной кислоты, нейропептида FMRFамида).

Впервые определено, что PGE₂-иммунореактивные структуры у плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta локализуются в центральной и периферической частях нервной системы, терминальных расширениях сенсорных окончаний и железистых клеток, а также в циртоцитах, позитивная иммунная реакция на PGD₂ также выявлена в циртоцитах, наряду с мышечными клетками. Это означает, что иммунорегуляторы PGЕ₂ и PGD₂ могут выделяться плероцеркоидами в ткани хозяина с поверхности свободных нервных окончаний и через протоки фронтальных желез в тегументе, а также выделительную систему.

Впервые для D. dendriticum определены концентрации простагландинов PGE₂ и PGD₂. Кроме того, нашими исследованиями доказано, что D. dendriticum секретирует PGE₂ и PGD₂ в ответ на инкубацию в сыворотке крови байкальского омуля.

Простагландины эукариотических паразитов играют двойную роль: осуществляют взаимодействие с хозяином на клеточном уровне и принимают участие в метаболизме или развитии организма паразита (Noverr et al., 2003). Нами показано, что иммунная реакция против PGE₂ и PGD₂ локализуется в местах непосредственного или опосредованного контакта с тканями хозяина. Таким образом, вырабатываемые плероцеркоидами D. dendriticum и L. interrupta простагландины PGE₂ и PGD₂ потенциально могут регулировать антипаразитический иммунный ответ их хозяев, изменяя его с типа Th1 на тип Th2, более выгодный для паразитов.

В организме карася серебряного PGЕ₂, выделяемый плероцеркоидами L. interrupta в ткани хозяина, может вызывать супрессию эозинофильных и базофильных форм гранулоцитов, подавляя клеточные иммунные механизмы, используемые хозяином для ликвидации паразитарных инвазий. С другой стороны, выявленные простагландины могут быть использованы плероцеркоидами D. dendriticum и L. interrupta для регуляции внутренних физиологических процессов. PGE₂ может использоваться для регуляции развития и функционирования нервной системы. PGD₂ может играть роль антагониста медиаторов, вызывающих сокращение мышечных клеток.

Нашими исследованиями установлено, что в ответ на воздействие сыворотки крови хозяев у плероцеркоидов наблюдается экскреция везикул с поверхности свободных нервных окончаний в поры тегумента. Нервные клетки гельминтов способны синтезировать широкий спектр молекул, идентичных функционирующим в организме хозяина, и, таким образом, могут управлять жизнедеятельностью хозяина, в частности его иммунными реакциями и поведением (Barber, Scharsack, 2010). В связи с этим, можно предположить, что выявленные нами у плероцеркоидов D. dendriticum и L. interrupta нейроактивные субстанции могут оказывать на организм байкальского омуля не только иммунорегуляторное, но и нейромодуляторное воздействие.

Экспериментальным путем была доказана регуляторная роль простагландина E₂, серотонина и ГАМК в отношении лейкоцитов рыб in vitro. Наиболее выраженное влияние PGE₂ наблюдали в долгосрочной культуре, где высокая концентрация PGE₂ вызывала негативное воздействие на жизнеспособность и активность лейкоцитов рыб, тогда как низкие концентрации усиливали жизнеспособность и активность лейкоцитов. Установлено, что концентрация PGE₂ в организме плероцеркоидов D. dendriticum соответствует максимальной концентрации PGE₂, использованной для экспериментов in vitro. Предполагается, что PGЕ₂, секретируемый плероцеркоидами D. dendriticum в ткани хозяев, может вызывать супрессию иммунного ответа этих хозяев.

Серотонин и ГАМК in vitro оказывают как супрессивное, так и стимулирующее воздействие на лейкоциты трехиглой колюшки, которое зависит от продолжительности культивирования и концентрации нейроактивных субстанций. Таким образом, эти нейроактивные субстанции, секретируемые цестодами, являются иммунорегуляторами и могут участвовать в регуляции иммунитета их хозяев.

Проведены исследования изменений лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб при заражении цестодами. При инвазии плероцеркоидов в организме рыб наблюдается активация воспалительных процессов. У D. dendriticum это связано с формированием капсулы вокруг плероцеркоидов цестод. Известно, что PGЕ₂ стимулирует секрецию тучными клетками про-ангиогенного медиатора – фактора роста сосудистого эндотелия, а также формирование фиброзных узлов, в которых обитают паразиты. Предполагается, что PGE₂, секретируемый D. dendriticum, может инициировать формирование соединительно-тканной капсулы вокруг плероцеркоидов.

Кроме того, у рыб происходит активация гуморального звена адаптивного иммунитета: в головном отделе почки байкальского омуля и карася серебряного усиливается пролиферация В-лимфоцитов. Известно, что адаптивные механизмы иммунитета у рыб играют меньшую роль, чем у наземных позвоночных (Knopf et al., 2000). Поэтому усиление гуморальных специфических иммунных реакций как у байкальского омуля, так и у карася серебряного, вероятно, не играет ключевой роли в элиминации паразита. Известно, что одни и те же особи карася в природных и экспериментальных условиях способны заражаться плероцеркоидами L. interrupta, как минимум, дважды и трижды на протяжении своей жизни (Дубинина, 1966), т.е. приобретенный иммунитет оказывается неэффективным по отношению к повторным инвазиям тем же видом паразита.

Наряду с усилением неспецифического и специфического иммунного ответа, в организме рыб при инвазии плероцеркоидами наблюдаются иммуносупрессивные явления. Плероцеркоиды D. dendriticum вызывают супрессию клеточного звена адаптивного иммунитета байкальского омуля.

Нужна помощь в написании автореферата?

Подробнее

При лигулезе в организме карася серебряного уменьшается интенсивность пролиферации бластных форм лейкоцитов, а также псевдобазофилов и псевдоэозинофилов, играющих важнейшую роль в развитии реакций цитотоксичности для уничтожения паразитов. Недавно было выявлено что, PGЕ₂ вызывает деактивацию ацидофильных гранулоцитов у рыб (Montero et al., 2016). Поэтому весьма вероятно, что причиной супрессии ацидофильных и базофильных форм гранулоцитов в органах иммунной системы карася серебряного при инвазии плероцеркоидов L. interrupta явилась именно секреция плероцеркоидами простагландина Е₂ и/или других иммунорегуляторных молекул в организм своего хозяина.

Изученные нами плероцеркоиды D. dendriticum и L. interrupta имеют различные стратегии по защите от иммунного ответа их промежуточных хозяев – рыб. D. dendriticum, в первую очередь, использует механизмы уклонения от иммунного ответа байкальского омуля.

Секретируя в организм хозяина иммунорегуляторные молекулы, потенциально включающие PGE₂, паразит стимулирует развитие вокруг себя соединительно-тканной капсулы, снабженной сетью кровеносных сосудов хозяина. С одной стороны, капсула защищает паразита от антипаразитарного иммунологического ответа хозяина. С другой стороны, через капсулу паразит обеспечивается необходимыми питательными веществами и способен длительное время существовать вплоть до поедания промежуточного хозяина окончательным хозяином. У L. interrupta, как и у других представителей ремнецов, наоборот, на фазе плероцеркоидной личинки осуществляется окончательный рост до размеров взрослого червя, почти заканчивается органогенез многочисленных половых систем.

Благодаря такой стратегии плероцеркоиды L. interrupta постоянно испытывают на себе активное сопротивление иммунной системы рыб, и эволюционно должны вырабатывать более эффективные защитные механизмы, включая регуляцию иммунитета рыб, по сравнению с плероцеркоидами D. dendriticum. Наши исследования подтвердили данную гипотезу: у L. interrupta, по сравнению с D. dendriticum, сильнее развит слой микротрихий; выше уровень секреции с поверхности тегумента как в контроле, так и при стимулировании сывороткой крови хозяев; больше клеточных источников синтеза простагландина Е₂ в организме; при инвазии L. interrupta процессы иммуносупрессии в организме рыб более выражены, чем при заражении D. dendriticum.

Заключение

В результате выполненной работы получены оригинальные и новые для науки данные о морфологических и биохимических особенностях плероцеркоидов цестод, отражающие адаптации паразитов к воздействию иммунной системы хозяев – рыб, а также о регулирующем влиянии плероцеркоидов цестод на характеристики иммунной системы рыб.

Реакции плероцеркоидов при воздействии сыворотки крови хозяев. Впервые для плероцеркоидов установлены возможные механизмы выведения иммунорегуляторных молекул в ткани хозяина. Установлена активация секреторной функции тегумента плероцеркоидов при воздействии сыворотки крови хозяев. На поверхности тегумента образуются выросты секрета двух форм: морфологически оформленные (характерны для Diphyllobothrium dendriticum и для Ligula interrupta) и неоформленные (характерны только для D. dendriticum).

У плероцеркоидов D. dendriticum выявлены различия между сколексом и телом, касающиеся процессов секреции в ответ на воздействие сыворотки крови: оформленные секреторные продукты наиболее интенсивно выводятся в сколексе, неоформленные секреторные продукты – в теле цестод.

При инкубировании с сывороткой крови в тегументе плероцеркоидов обнаружен как апокриновый, так и мерокриновый тип секреции. Кроме того, выявлена экскреция везикул с поверхности свободных нервных окончаний в поры тегумента. Дистальная цитоплазма тегумента цестод в ответ на воздействие сыворотки крови реагирует увеличением количества отдельных органоидов: в тегументе D. dendriticum и L. interrupta значительно увеличивается количество и размеры палочковидных гранул; у D. dendriticum увеличивается количество и размеры дисковидных тел, у interrupta – везикул и вакуолей.

Установлено, что в ответ на инкубирование с сывороткой крови у L. interrupta наблюдается более интенсивная реакция тегумента, чем у D. dendriticum: максимальное число секреторных выростов апокринового типа на единицу площади на поверхности тегумента у L. interrupta в 50 раз больше, чем у D. dendriticum. Продуцируемый секрет является потенциальным источником иммунорегуляторных веществ, переносимых от плероцеркоидов в ткани хозяев – рыб.

Доказано, что цестоды секретируют иммунорегуляторные вещества в ответ на воздействие сыворотки крови их хозяев. Впервые в организме плероцеркоидов цестод методом ВЭЖХ была определена концентрация простагландинов E₂ и D₂. Этим же методом доказано, что плероцеркоиды D. dendriticum в ответ на воздействие сыворотки крови хозяина секретируют простагландины E₂ и D₂ в инкубационную среду с максимумом секреции через 12 ч после начала инкубации.

Локализация иммунорегуляторных молекул в организме плероцеркоидов. Впервые у плероцеркоидов выяснена биохимическая природа отдельных потенциальных иммунорегуляторных молекул. Впервые изучено распределение иммунорегуляторных молекул в организме плероцеркоидов, определены возможные клеточные источники их синтеза. В результате иммуноцитохимических исследований нами впервые в организме изученных плероцеркоидов были идентифицированы простагландины E₂ и D₂ (PGE₂ и PGD₂).

Иммунореакция на PGE₂ у плероцеркоидов выявлена в центральном и периферическом отделах нервной системы, терминальных расширениях сенсорных окончаний и железистых клеток, а также в циртоцитах. У L. interrupta, кроме того, интенсивная иммунная реакция на PGE₂ выявлена в цитонах тегумента. Позитивная иммунная реакция на PGD₂, главным образом, связана с мышечными клетками, а также с циртоцитами. Таким образом, иммунорегуляторы PGЕ₂ и PGD₂ могут выделяться плероцеркоидами в ткани хозяина с поверхности свободных нервных окончаний в тегументе, через протоки фронтальных желез и выделительную систему.

В нервной системе D. dendriticum и L. interrupta исследовано распределение нейроактивных субстанций, потенциальных нейро- и иммунорегуляторов: серотонина (5-HT), γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), нейропептида FMRFамида. Впервые исследована иммуноцитохимическая организация нервной системы L. interrupta. Нейроактивные субстанции выявлены в центральном и периферическом отделах нервной системы цестод. Показано, что 5-HT, ГАМК и FMRFамид занимают различные части в нервной системе плероцеркоидов, ко-локализация этих веществ не выявлена.

В нервной системе цестод D. dendriticum и L. interrupta впервые выявлены тела ГАМКергических нейронов. Установлено, что ГАМК-иммунореактивные (ИР) нейроны расположены в главных стволах, а также на некотором удалении от нейропилей. Расположение ГАМК-ИР отростков приурочено к мышечным слоям, в том числе интенсивная ГАМК-ИР обнаружена на периферии, в зоне субтегумента. Установлено, что в церебральном ганглии и главных нервных стволах D. dendriticum и L. interrupta серотонинергические нейроны занимают латеральную позицию, их отростки проходят в дорзальном и вентральном направлении. FMRFамидергические элементы занимают противоположную позицию серотонинергическим частям.

Влияние in vitro потенциальных иммунорегуляторных молекул плероцеркоидов на показатели лейкоцитов рыб. Впервые для цестод изучено влияние синтезируемых ими отдельных иммунорегуляторных веществ на характеристики иммунокомпетентных клеток. Доказана иммунорегуляторная роль простагландина E₂, серотонина и ГАМК. Исследовано влияние этих веществ in vitro на культуру лейкоцитов трехиглой колюшки. Установлено, что простагландин E₂ изменяет жизнеспособность лейкоцитов, соотношение гранулоцитов и лимфоцитов, продукцию лейкоцитами реактивных форм кислорода.

Наиболее выраженное влияние PGE₂ наблюдали в долгосрочной культуре, где высокая концентрация PGE₂ вызывала негативное воздействие на жизнеспособность и активность лейкоцитов рыб, тогда как низкие концентрации усиливали жизнеспособность и активность лейкоцитов. Установлено, что концентрация PGE₂ в организме плероцеркоидов D. dendriticum соответствует максимальной концентрации PGE₂, использованной для экспериментов in vitro.

Предполагается, что PGЕ₂, секретируемый плероцеркоидами D. dendriticum в ткани хозяев, может вызывать супрессию иммунного ответа этих хозяев. Серотонин и ГАМК in vitro оказывают как супрессивное, так и стимулирующее воздействие на лейкоциты трехиглой колюшки, которое зависит от продолжительности культивирования и концентрации нейроактивных субстанций.

В краткосрочной культуре ГАМК в высоких и средних концентрациях снижает продукцию реактивных форм кислорода лейкоцитами. В долгосрочной культуре воздействие высоких и средних концентраций ГАМК вызывает увеличение жизнеспособности лейкоцитов; при этом соотношение гранулоциты/лимфоциты и кислородный взрыв увеличиваются под воздействием всех исследованных концентраций. Серотонин в краткосрочной культуре во всех исследованных концентрациях снижает продукцию реактивных форм кислорода лейкоцитами.

В долгосрочной культуре воздействие высоких концентраций серотонина вызывает снижение жизнеспособности лейкоцитов. Кислородный взрыв, наоборот, усиливается, при воздействии как высоких, так и низких концентраций серотонина. Таким образом, эти нейроактивные субстанции, секретируемые цестодами, являются иммунорегуляторами и могут участвовать в регуляции иммунитета их хозяев.

Нужна помощь в написании автореферата?

Цена автореферата

Изменение лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб при инвазии плероцеркоидами. Доказано, что в естественных условиях цестоды способны активно регулировать иммунную систему своих хозяев. Определены изменения лейкоцитарного состава органов иммунной системы рыб при инвазии плероцеркоидами цестод. Установлено, что инвазия плероцеркоидами вызывает развитие воспалительных реакций у рыб. У байкальского омуля при инвазии D. dendriticum в результате воспалительной реакции формируется капсула вокруг паразитов. В головной почке байкальского омуля наблюдается увеличение общего количества нейтрофилов, происходит миграция нейтрофилов из головной почки и селезенки в кровеносное русло и далее – к месту формирования капсулы.

Напротив, у серебряного карася, зараженного плероцеркоидами L. interrupta, капсула вокруг паразитов не формируется, однако количество нейтрофилов в туловищном отделе почки и селезенке увеличивается. Нейтрофилы в организме карася участвуют в удалении продуктов метаболизма плероцеркоидов L. interrupta и тканей рыб, поврежденных в результате роста паразитов.

Кроме того, происходит активация гуморального звена адаптивного иммунитета: в головном отделе почки байкальского омуля и карася серебряного усиливается пролиферация В-лимфоцитов. Зрелые формы лимфоцитов мигрируют из почки в селезенку – основное место презентации антигена и активации адаптивного иммунного ответа рыб. Наряду с усилением неспецифического и специфического иммунного ответа, в организме рыб при инвазии плероцеркоидами наблюдаются иммуносупрессивные явления. D. dendriticum вызывает супрессию клеточного звена адаптивного иммунитета байкальского омуля. При лигулезе в организме карася серебряного уменьшается интенсивность пролиферации бластных форм лейкоцитов, а также псевдобазофилов и псевдоэозинофилов, играющих важнейшую роль в развитии реакций цитотоксичности для уничтожения паразитов.

Проведен сравнительный анализ иммунологических реакций промежуточных (байкальский омуль) и окончательных (сирийский хомячок) хозяев при инвазии D. dendriticum. Установлено, что D. dendriticum регулирует иммунный ответ хозяев как на стадии плероцеркоида, так и в половозрелом состоянии.

Анализ иммунологических реакций радужной форели при заражении патогенными бактериями F. psychrophilum выявил дифференциальную регуляцию экспресии провоспалительных цитокинов, их рецепторов и острофазных белков. Показано, что патогенные бактерии, в отличие от цестод, не оказывают регуляторного влияния на иммунный ответ рыб.

Список использованных источников

1. Kutyrev I. A. Prostaglandins E2 and D2 – regulators of host immunity in the model parasite Diphyllobothrium dendriticum: an immunocytochemical and biochemical study / I. A. Kutyrev, N. M. Biserova, D. N. Olennikov, Z. V. Korneva, O. E. Mazur // Mol. Biochem. Parasitol. – 2017. – V. 212. – P. 33-45.
2. Kutyrev I. A. Dataset of proinflammatory cytokine and cytokine receptor gene expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) measured using a novel GeXP multiplex, RT-PCR assay / I. A. Kutyrev, B. Cleveland, T. Leeds, G. D. Wiens // Data in Brief. – 2017. – V. 11. – P. 192-196.
3. Kutyrev I. A. Proinflammatory cytokine and cytokine receptor gene expression kinetics following challenge with Flavobacterium psychrophilum in resistant and susceptible lines of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) / I. A. Kutyrev, B. Cleveland, T. Leeds, G. D. Wiens // Fish Shellfish Immunol. – 2016. – V. 58. – P. 542- 553.
4. Мазур О. Е. Морфофункциональные особенности эритроидного ростка крови серебряного карася, зараженного Ligula (Digramma) interrupta (Cestoda: Pseudophyllidea) / О. Е. Мазур, И. А. Кутырев, Ж. Н. Дугаров // Научная жизнь. – 2016. – № 11. – С. 104-113.
5. Kutyrev I. A. In vitro effects of prostaglandin E2 on leucocytes from sticklebacks (Gasterosteus aculeatus) infected and not infected with the cestode Schistocephalus solidus / I. A. Kutyrev, F. Franke, J. Büscher, J. Kurtz, J. P. Scharsack // Fish Shellfish Immunol. – 2014. – V. 41. – P. 473-481.
6. Biserova N. M. GABA in the nervous system of the Cestodes Diphyllobothrium dendriticum (Diphyllobothriidea) and Caryophyllaeus laticeps (Caryophyllidea), with comparative analysis of muscle innervation / N. M. Biserova,
I. A. Kutyrev, K. Jensen // J. Parasitol. – 2014. – V. 100, № 4. – P. 411-421.
7. Бисерова Н. М. Особенности локализации простагландина E2, γ- аминомасляной кислоты и других потенциальных иммуномодуляторов у плероцеркоида Diphyllobothrium dendriticum (Cestoda) / Н. М. Бисерова, И. А. Кутырев // Известия РАН. Серия биологическая. – 2014. – № 3. – С. 271–280.
8. Кутырев И. А. Простагландин Е2 как потенциальный иммуномодулятор лентеца чаечного / И. А. Кутырев, Н. М. Бисерова, Й. П. Шарсак, Й. Куртц // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2012. – № 5. – С. 245-249.
9. Averina E. S. Perspectives of using of marine and freshwater hydrobionts oils for development of drug delivery systems / E. S. Averina, I. A. Kutyrev // Biotechnol. Adv. – 2011. – V. 29, № 5. – P. 548-557.
10. Бисерова Н. М. Ленточный червь Diphyllobothrium dendriticum (Cestoda) продуцирует простагландин Е2 – регулятор иммунитета хозяина / Н. М. Бисерова, И. А. Кутырев, В. В. Малахов // Доклады Академии Наук. – 2011. – Т. 441. – № 1. – С. 126-128.
11. Кутырев И. А. Лейкоцитарный состав головного отдела почки карася серебряного Carassius аuratus Gibelio (Cypriniformes: Cyprinidae) и влияние на него инвазии цестоды Digramma interrupta (Cestoda: Pseudophyllidea) / И. А. Кутырев, Н. М. Пронин, Ж. Н. Дугаров // Известия РАН. Серия биологическая. 2011. – № 6. – С. 759-763.
12. Кутырев И. А. Изменение состава тучных клеток 12-перстной кишки сирийского хомяка при экспериментальном заражении Diphyllobothrium dendriticum (Cestoda: Pseudophyllidae) / И. А. Кутырев, С. В. Пронина // Морфология. – 2010. – Т. 137, № 2. – С. 44-47.
13. Пронина С. В. Морфофункциональные и иммунологические аспекты патогенеза дифиллоботриоза, вызываемого Diphyllobothrium dendriticum (Pseudophyllidea: Diphyllobothriidae) у сирийского хомяка в эксперименте / С. В. Пронина, И. А. Кутырев, Л. В. Толочко, О. Е. Мазур, Н. М. Пронин // Вестник Бурятской государственной сельскохозяйственной академии. – 2010. – № 3. – С. 25-31.
14. Кутырев И. А. Изменение клеточного состава брыжеечных лимфатических узлов сирийского хомяка при экспериментальном заражении Diphyllobothrium dendriticum (Cestoda: Pseudophyllidae) / И. А. Кутырев // Вестник Бурятской государственной сельскохозяйственной академии. – 2009. – № 4. – С. 17-22.
15. Пронин Н. М. Структура Байкальского природного очага дифиллоботриоза и взаимоотношения Diphyllobothrium dendriticum с дефинитивными хозяевами / Н. М. Пронин, С. В. Пронина, И. А. Кутырев // Известия Иркутского государственного университета. Серия «Биология. Экология». – 2009 – № 1. – С. 53-56.
16. Кутырев И. А. Иммунологические коадаптации паразита и хозяина / И. А. Кутырев // Сб. науч. тр. с междунар. участием. Серия: химия и биологически активные вещества природного происхождения. Выпуск 16. – Улан-Удэ, 2011. – С. 128-132.
17. Kutyrev I. A. Prostaglandin E2 as a Cestodes immunomodulator / I. A. Kutyrev, J.P. Scharsack, N. M. Biserova, J. Kurtz // XI European multicolloquium of parasitology, July 25-29, 2012, Cluj-Napoca, Romania: Program and abstract book. – Cluj-Napoca, 2012. – P. 280.
18. Kutyrev I. A. Immune response of Baikal omul to diphyllobothriasis / I. A. Kutyrev, S. V. Pronina, N. M. Pronin // GORDON Research Conference on Immunochemistry and Immunobiology, May 16-21, 2010, Les Diablerets, Switzerland: Abstracts. – Les Diablerets, 2010. – P. 67.
19. Kutyrev I. A. Influence of Diphyllobothrium dendriticum invasion on cell composition of hamster’s mesenteric lymph node and duodenum / I. A. Kutyrev, S. V. Pronina, N. M. Pronin // The Impact of the Environment on Innate Immunity: The threat of Diseases: ESF-FWF Conference in Partership with LFUI, 4-9 May, 2009, Obergugl, Austria: Program and abstract book. – Obergugl, 2009. – P. 42.
Материалы всероссийских конференций
20. Кутырев И. А. Иммунологические аспекты взаимоотношений в системе «цестоды — рыбы» / И. А. Кутырев, Н. М. Бисерова, Й. Куртц Й. Шарсак, С. В. Пронина, О. Е. Мазур, Ж. Н. Дугаров, Н. М. Пронин // Школа по теоретической и морской паразитологии: Сб. научн. статей по мат. научн. докл. на VI всероссийск. конф. с междунар. участием (г. Севастополь, 5–10 сентября 2016 г.). – Севастополь, 2016. – С. 90-93.
21. Кутырев И. А. Морфофункциональные особенности распределения простагландина E2 в организме Diphyllobothrium dendriticum / И. А. Кутырев, Н. М. Бисерова // Разнообразие Почв и Биоты Северной и Центральной Азии: Тез. III всероссийск. конф. с междунар. участием (Улан-Удэ, 21-23 июня 2016 г.). – Улан- Удэ, 2016. – С. 192-194.
22. Кутырев И. А. Простагландин Е2 как потенциальный иммуномодулятор в паразито-хозяинной системе «цестоды-рыбы» / И. А. Кутырев, Й. П. Шарсак, Й. Курц // Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы: Мат. III всероссийск. конф. молодых ученых (Улан-Удэ, 16-21 сентября 2013 г.). – Улан-Удэ, 2013. – С. 141-142.
23. Кутырев И. А. Исследование влияния потенциальных иммуномодуляторов цестод на примере культуры лейкоцитов обыкновенной трёхиглой колюшки Gasterosteus aculeatus / И. А. Кутырев, Й. П. Шарсак, Й. Курц // Современные проблемы общей паразитологии: Мат. междунар. научн. конф. (30 октября –1 ноября 2012 г., г. Москва). – Москва, 2012. – С. 190-194.
24. Кутырев И. А. Биологически активные вещества паразитов – модуляторы иммунной системы хозяев / И. А. Кутырев, Н. М. Бисерова // Разнообразие почв и биоты северной и центральной Азии: Мат. II междунар. научн. конф. (Улан-Удэ, 20-25 июня 2011 г.), Т. 3. – Улан-Удэ, 2011. – С. 73-75.
25. Кутырев И. А. Изменение лейкоцитарного состава головного отдела почки карася серебряного при диграммозе / И. А. Кутырев, Н. М. Пронин, Ж. Н. Дугаров // Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов: Расширенные мат. III междунар. конф. (Борок, 18-22 июля 2011 г.) – Борок, 2011. – С. 177-178.
26. Кутырев И. А. Изменения лейкоцитарного состава органов иммунной системы байкальского омуля при дифиллоботриозе / И. А. Кутырев, С. В. Пронина, Н. М. Пронин // Пресноводная аквакультура Европы и Азии: реалии и перспективы развития и сотрудничества: Мат. междунар. научн.-практич. конф. (Улан-Удэ 1-7 августа 2011 г.). – Улан-Удэ, 2011. – С. 106-107.
27. Пронина С. В. Клеточно-тканевые реакции дефинитивных хозяев при инвазии Diphyllobothrium dendriticum (Nitzsh, 1824) / С. В. Пронина, О. Е. Мазур, И. А. Кутырев, А. С. Фомина // Разнообразие почв и биоты северной и центральной Азии: Мат. II междунар. научн. конф. (Улан-Удэ, 20-25 июня 2011 г.), Т. 2. – Улан-Удэ, 2011. – С. 223-225.
28. Пронина С. В. Морфологические и иммунные реакции золотистого хомяка при экспериментальном дифиллоботриозе, вызываемом лентецом Diphyllobothrium dendriticum (Nitsch, 1824) (Cestoda: Pseudophyllidae) / С. В. Пронина, О. Е. Мазур, Н. М. Пронин, И. А. Кутырев, Л. В. Толочко, А.С. Фомина // Мат. докл. II Юбилейной науч.-практич. конф. с междун. участием (г. Кемерово, 25-27 мая 2011 г.). – Кемерово, 2011. – С. 58-65.
29. Кутырев И. А. Иммунологические аспекты взаимоотношений в системе «паразит-хозяин» / И. А. Кутырев // Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы: Мат. всероссийск. конф. молодых ученых. – Улан-Удэ, 14-17 сентября 2010 г. – Улан-Удэ, 2010. – С. 137-139.
30. Кутырев И. А. Лейкоцитарный состав органов иммунной системы байкальского омуля / И. А. Кутырев // Ломоносов-2010: Мат. междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. Секция «Биология». (Москва, 12-15 апреля 2010 г.). – Москва, 2010. – С. 302.
31. Кутырев И. А. Поиск иммуномодуляторов в организме плероцеркоида diphyllobothrium dendriticum / И. А. Кутырев, Н. М. Бисерова // Паразиты Голарктики: Мат. междунар. симп. (Петрозаводск, 4-8 октября 2010 г.). – Петрозаводск, 2010. – С. 148-151.
32. Кутырев И. А. Нейроактивные субстанции как возможные иммуномодуляторы в нервной системе плероцеркоида Diphyllobothrium dendriticum / И. А. Кутырев, Н. М. Бисерова // Теоретические и практические проблемы паразитологии: Мат. междунар. научн. конф. (Москва, 30 ноября – 3 декабря 2010 г.). – Москва, 2010. – С. 198-202.
33. Кутырев И. А. Изменение содержания тучных клеток 12-перстной кишки и брыжеечных лимфатических узлов сирийского хомяка при экспериментальном заражении лентецом Diphyllobothrium dendriticum Nitsch., 1824 / И. А. Кутырев, С. В. Пронина, Н. М. Пронин // Актуальные проблемы электрофизиологии и незаразной патологии животных: Мат. междунар. научн.- практич. конф. (Улан-Удэ, 26-28 июня 2009 г.), Ч. 2. – Улан-Удэ, 2009. – С. 39-41.
34. Кутырев И. А. Функциональная активность тучных клеток 12- перстной кишки сирийского хомяка при экспериментальном заражении лентецом Diphyllobothrium dendriticum Nitsch., 1824 / И. А. Кутырев, С. В. Пронина // Паразитологические исследования в Сибири и на Дальнем Востоке: Мат. III межрегиональной научн. конф. паразитологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 15-20 сентября 2009 г.). – Новосибирск, 2009. – С. 154-155.
35. Кутырев И. А. Клеточный состав брыжеечных лимфатических узлов сирийского хомяка Mesocricetus auratus при заражении лентецом чаечным Diphyllobotrium dendriticum // Актуальные вопросы инвазионной и инфекционной патологии животных: Мат. междунар. научн.-практич. конф. – Улан-Удэ, 2008. – С. 33-35.
36. И. А. Кутырев. Имеются ли половые различия зараженности байкальского омуля плероцеркоидами лентеца чаечного Diphyllobothrium dendriticum Nitsch, 1824 (Cestoda: Pseudophilidae)? / И. А. Кутырев, С. В. Пронина, Н. М. Пронин // Молодежь и наука Забайкалья: Мат. молодежн. научн. конф. – Чита. – 2008. – С. 95-96.
37. Пронина С. В. Морфофункциональные изменения в органах иммунной системы золотистых хомяков, экспериментально зараженных лентецом чаечным Diphyllobotrium dendriticum Nitzsch, 1824 / С.В. Пронина, И. А. Кутырев, Н. М. Пронин // Паразитология в XXI веке: проблемы, методы, решения: Мат. IV всероссийск. съезда паразитологического общества при РАН. – Санкт-Петербург, 2008. – С. 64-69.
38. Кутырев И. А. Оценка влияния лентеца чаечного Diphyllobothrium dendriticum на микроморфологию бурсы птенцов чайки серебристой / И. А. Кутырев, С. В. Пронина, Н. М. Пронин // Мат. IV Всероссийск. шк. по теор. и морской паразитологии. – Калининград, 2007. – С. 127.

Предыдущий пример

Следующий пример