Ключевые слова: экспериментальная ишемия, противоишемическая активность, микроциркуляция, лазерная доплеровская флуометрия.
Введение. В настоящее время создание репарационного препарата, обладающего высокой репаративной способностью, является очень актуальной задачей для современной медицины и фармакологии, так как имеется высокий спрос, который покрывается лишь на 40%. Основой для его создания могут служить бета-тимозины, которые, на наш взгляд, являются очень перспективными для исследования.
Бета-тимозины представляют собой семейство высоко консервативных полярных пептидов с молекулярной массой 5 кДа. Один из представителей данного семейства-Тимозин β4 [3, 9, 11]. После травмы кожи, высокие уровни Тимозин β4 естественным образом присутствуют (13 мкг / мл) в раневой жидкости [8, 10]. Он также выступает в качестве основной молекулы комплексообразующего актина во всех эукариотических клетках и является мощным регулятором актина полимеризации у млекопитающих [7]. Тимозин β4связывается с G-актином, блокирует актин полимеризацию с фактором XIIIa тромбоцитов, оказывая большое влияние на процесс заживления ран [4, 6, 8]. На основе его многофункциональной деятельности во время регенерации тканей в различных экспериментах на животных, Тимозин β4 имеет потенциал для новых исследований, в области почек и печени, а также восстановления спинного мозга, костей и повреждения связок. Кроме того, он может быть полезен при лечении широкого спектра других заболеваний, в том числе в отношении последствий застарелых бактериальных повреждений и вирусных инфекций.
Несмотря на то, что интерес к изучению свойств и структуры Тимозина β4 зародился 30 лет назад — изучена лишь малая часть свойств данного пептида.
Материалы и методы. Эксперименты проведены на 170 крысах линии «Wistar» массой 250-300 г. В ходе эксперимента животные содержались в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты, температура воздуха составляла 22-24 0С, освещение – 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду. Все исследования проводили в одно и то же время суток во второй половине дня с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). Наркотизацию осуществляли внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса. Выведение животных из эксперимента – его передозировкой.
Животных распределяли по группам (не менее 10 крыс в группе) путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, условиям содержания и питания, а также по проводимым операциям и манипуляциям.
Моделирование ишемии мышц голени. Все крысы были разделены на 2 группы: контрольную и опытную. Животные контрольной серии представлены 12 группами, по 10 крыс в каждой. У животных первой группы – интактных – оценивали уровень микроциркуляции в мышцах правой голени. Далее проводили морфологическое исследование. Крысам 2й и 3й групп были ложнооперированными. Оценку уровня микроциркуляции и морфологическое исследование мышц на 21-е и 28-е сутки [2,5,6]. У других 9 групп крыс контрольной серии измеряли уровень микроциркуляции и проводили морфологическое исследование на различных сроках после моделирования патологии. Животным контрольной серии, а так же животным опытной серии моделировали ишемию мышц голени правой задней конечности. Моделирование ишемии мышц голени осуществляли под наркозом, фиксировав животное в положении «на спине». Шерсть на внутренней поверхности бедра тщательно выстригали, кожу обрабатывали 70% раствором спирта. Разрез кожи осуществляли вдоль бедра по внутренней поверхности. Выделяли элементы сосудисто-нервного пучка бедра. Артерию отделяли от вены и нерва, лигатуру накладывали у места ее начала, до отхождения a. saphena (под паховой связкой). Перевязывали и пересекали a. saphena. Выделяли подколенную артерию и начальные отделы артерий голени (передняя и задняя большеберцовые артерии), которые пересекали не перевязывая. Затем пересекали бедренную артерию на 3 мм ниже наложенной ранее лигатуры. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию и начальные отделы передней и задней большеберцовых артерий удаляли. Ретроградного кровотечения из артерий голени не наблюдалось. Рану на бедре ушивали непрерывным швом [2,7,8]. После моделирования патологии измеряли уровень микроциркуляции в мышцах голени на сроках 30 мин, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 90 сутки. В группах, выводившихся из эксперимента на сроках 21, 28 сутки, дополнительно проводили морфологическое исследование мышцы. Опытная серия состоит из 2 групп крыс (n=10). Все модели ишемии корректировались применением дериватами тимозина бета 4 животных выводили из эксперимента на 21 и 28 сутки. Перед этим производили оценку уровня микроциркуляции в ишемизированных мышцах голени, а так же их морфологическое исследование. Уровень микроциркуляции в мышцах голени измеряли на оборудовании Biopac systems: полиграфа MP100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и инвазивного игольчатого датчика TSD144. Данные обрабатывали с помощью программы AcqKnowledge 3.8.1. Значения микроциркуляции измеряли в перфузионных единицах (ПЕд). Забор исследуемой мышцы для морфологического исследования осуществляли по окончании процедуры ЛДФ. Цифровые данные обрабатывали методами вариационной статистики: вариационные ряды проверяли на нормальность распределения, при его соблюдении количественные величины характеризовали средней арифметической (М) и ошибкой средней (m), статистическую значимость количественных величин оценивали по критерию Стьюдента (t); статистическую значимость различий между морфологическими изменениями после их ранжирования оценивали с помощью метода анализа не параметрических данных Манна-Уитни.
Результаты исследования. Среднее значение уровня микроциркуляции в интактных мышцах
голени крыс составляло 532±28 ПЕд (перфузионных единиц). Результат не имеет значимых отличий от результатов, полученных другими авторами [1, 2]. При гистологическом исследовании миоциты образуют плотные пучки. В их толще проходят полнокровные венулы и артериолы, которые имеют единичные эритроциты. Просветы сосудов широкие, эндотелиальные клетки без патологических изменений. После моделирования патологии уровень микроциркуляции в них резко падал. Восстановление его начиналось лишь после 14 суток, но до 90 суток остается достоверно ниже значения, зарегистрированного в группе интактных животных. Учитывая результаты, полученные в ходе данного исследования, а также литературные данные, как наиболее показательными расценены 28 сутки эксперимента (21 – промежуточные). На 21 сутки патологии пораженная мышца макроскопически выглядела набухшей. В ней виднелись широкие участки серовато-коричневатого цвета. Эти участки при гистологическом исследовании представляли собой крупные очаги обособленного некроза с резорбцией некротических волокон и разрастанием грануляционной ткани. На 28 сутки цвет мышцы становился естественным, но выглядела она немного гипотрофичной. При детальном гистологическом исследовании участки резорбируемого некроза были заметно мельче. В микроциркуляторном русле наблюдали полнокровие и новообразование единичных капилляров. Возле участков некроза встречались пучки атрофированных мышечных волокон.
Среднее значение уровня микроциркуляции в мышцах голени ложнооперированных крыс составляло на 21 сутки 312±21ПЕд на 28 сутки – 396±14 ПЕд. Показатели лазерной допплеровской флоуметрии не имеют достоверных отличий от показателей, которые были получены в группе интактных животных , при гистологическом исследовании отличий от строения интактных мышц животных выявлено не было, поэтому при последующем изложении для удобства мы будем называть их интактными. При оценке уровня микроциркуляции в опытных группах было выявлено, что влияния смеси дериватов тимозина β4 способствовало эффективному и равнозначному повышению уровня регионарного кровотока в ишемизированной мышце голени крыс. Показатели ЛДФ в этих группах достоверно выше таковых в контрольной группе на соответствующем сроке. При морфологическом исследовании макроскопически мышцы ишемизированной голени во всех опытных группах на 21-е и 28-е сутки эксперимента не отличались по цвету и виду от мышц интактных крыс. При микроскопии некротические изменения в мышцах не обнаруживались, но в единичных участках встречались мелкие очаги атрофирующихся миоцитов с пролиферацией клеток перимизия. При всех видах изучаемых воздействий в мышцах ишемизиованной голени отмечалось усиленное новообразование капилляров, более выраженное на 28 сутки эксперимента.
Выводы.
Анализ результатов в опытных группах показал, что применение дериватов тимозина бета 4 стимулирует неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс. Свидетельством этого являются результаты ЛДФ и морфологического исследования. Уровень микроциркуляции в ишемизированных мышцах голени животных всех опытных групп на 21 сутки приближается к показателям в группе интактных животных, а на 28 сутки значительно выше.
Список использованных источников
1. Возможности комбинированной фармакологической и хирургической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, А.Д. Мясников и др. // Рос. мед.- биолог. вестн. им. акад. И.П. Павлова. — 2008. — № 1. — С. 8-13.
2. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте
/ Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, М.В. Покровский и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. — 2008. — Т. 71. № 3. — С. 23-25.
3. Arteriogenesis proceeds via ICAM-1/Mac-1- mediated mechanisms / I.E. Hoefer // Circulation Research. – 2004.– №94. – P. 1179-1185.[PubMed][Full text]
4. Complete amino acid sequence of bovine thymosin beta 4: A thymic hormone that induces terminal deoxynucleotidyltransferase activity in thymocyte populations. / T. Low, S.-K. Hu, L.T. Goldstein // Proceeding of the National Academy of Sciences of the. – 1981.– №78. – P. 1162-1166. [PubMed]
5. Endothelium dependent relaxation of collateral microvessels after intramuscular gene transfer of vascular endothelial growth factor in a rat model of hindlimb ischemia / A. Takeshita // Circulation. – 1998. – Vol. 98. – P. 1261-1263.
6. Intramuscular gene transfer of soluble tumor necrosis factor-α activates vascular endothelial growth factor receptor and accelerates angiogenesis in a rat model hindlimb ischemia / C. Sugano // Circulation. – 2004. – Vol. 109. – P. 797-802.
7. Occurrence of thymosinβ4 in human breast cancer cells and in other cell types of the tumor microen-vironment / L.I. Larsson, S. Holck // Human Pathology. – 2007.– №38. – P.114–119. [PubMed]
8. The endothelial surface of growing coronary collateral arteries. Intimal margination and diapedesis of monocytes. A combined SEM and TEM study / J. Schaper, R. Konig, D. Franz [et al.] //Virchows Arch A Pathol Anat Histol. – 1976.– №370. – P. 193-205.[PubMed]
9. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity / M. Muracami // Journal of Clinical Investigation. – 2008.– №118. – P. 3355-3366.[PubMed][Full text]
10. Thymosin beta4 activates integrin-linked kinase and promotes cardiac cell igration, survival and cardiac repair / I. Bock-Marquette, A. Saxena, M.D. White [et al.] // Nature. – 2004 – №432. – P.466-472. [PubMed] [Full text]
11. Thymosinβ4 triggers an epithelial-mesenchymal transition in colorectal carcinoma by upregulating integrin-linked kinase / H. Huang, C. Hu, M. Tang [et al.] // Oncogene. – 2007. – №26. – P. 2781-2790. [PubMed][Fulltext]